費用対効果の高いトランスクリプトームベースの薬物スクリーニング

要約

このプロトコルは費用効果が大きいトランスクリプトーム ベースの薬剤のスクリーニングのためのex 生体内 または 生体外の 細胞培養からのトランスクリプトーム データ前処理へのワークフローを記述する。

要約

トランスクリプトミクスは、細胞プログラムとその摂動に対する応答に関する包括的な洞察を得ることができます。過去10年間でライブラリーの作製とシーケンシングのコストが大幅に低下したにもかかわらず、これらの技術を薬物スクリーニングに必要な規模で適用することは依然として法外なコストがかかり、これらの方法の計り知れない可能性を妨げています。本研究は、小型の摂動培養とミニバルクトランスクリプトミクスを組み合わせた、トランスクリプトームベースの薬物スクリーニングのための費用対効果の高いシステムを提示しています。最適化されたミニバルクプロトコルは、費用対効果の高いシーケンシング深度で有益な生体シグナルを提供し、既知の薬物や新しい分子の広範なスクリーニングを可能にします。選択した治療とインキュベーション時間に応じて、このプロトコルは約2日以内にライブラリのシーケンシングになります。このプロトコル内にはいくつかの停止ポイントがあるため、ライブラリ調製とシーケンシングは時間に依存しない状態で行うことができます。多数のサンプルを同時に処理することが可能です。最大384サンプルの測定は、データ品質を損なうことなくテストされました。また、最適な薬物インキュベーション時間のばらつきを考慮しているにもかかわらず、条件および/または薬物の数に既知の制限はありません。

概要

新薬の開発は、候補となる医薬品とその標的の特定、医薬品候補の最適化と合成、前臨床試験および臨床試験での有効性と安全性の検証を含む、複雑で時間のかかるプロセスです¹。従来の薬物スクリーニングの方法、すなわち治療目的で候補化合物のライブラリーを系統的に評価する方法では、動物モデルまたは細胞ベースのアッセイを使用して、特定の標的または経路に対する効果を試験します。これらの手法は、医薬品候補の同定には成功していますが、薬効の根底にある複雑な分子メカニズムや、毒性、潜在的な副作用のメカニズムについては、十分な洞察が得られないことが多かったのです。

ゲノムワイドな転写状態を評価することは、薬物治療に反応した遺伝子発現の包括的な評価を可能にするため、薬物スクリーニングにおける現在の限界を克服するための強力なアプローチを提示します²。トランスクリプトミクスは、ある時点で発現するRNA転写産物をゲノムワイドに測定することにより、遺伝子発現パターン、選択的スプライシング、ノンコーディング^{RNA発現の変化}など、薬物に反応して起こる転写変化の全体像を提供することを目的としています3。この情報は、薬物標的の決定、薬物の有効性と毒性の予測、薬物の投与と治療計画の最適化に使用できます。

トランスクリプトミクス....

プロトコル

このプロトコルは、ボン大学の地元の倫理委員会のガイドラインに従います。

1. 緩衝液、溶液、装置の調製

1. 溶液を調製し、 材料表に記載されている材料を収集します。
2. ウォーターバスを37°Cに加熱し、完全な増殖培地(RPMI-1640 + 10%ウシ胎児血清(FCS)+ 1%ペニシリン/ストレプトマイシン)を温めます。
3. 細胞回収には、氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用します。
   注:細胞を操作している間は、無菌性を維持するために清潔な環境を保ちます。

2. 細胞の取り扱い

注:ヒト血液からの末梢血単核球(PBMC)の凍結保存に関する詳細なプロトコルは、⁷に記載されています。

1. 細胞の融解とカウント
   1. 液体窒素からクライオバイアルを取り出し、37°Cのウォーターバスで2〜3分間、静かに反転させながら解凍します。
   2. 融解した細胞を50 mLのコニカルチューブに移します。
   3. クライオバイアルを1 mLの温かい完全増殖培地ですすぎ、この溶液をチューブ内の細胞に滴下します(^....

ディスカッション

創薬や創薬は、バルクトランスクリプトミクスが提供できる細胞プロセスの全体像から大きな恩恵を受けることができます。しかし、このアプローチは、標準的なバルクRNA-seqプロトコルを用いた実験のコストが高いため、学術的な環境での応用が妨げられることや、産業的なスケーラビリティの可能性が妨げられることが多くあります。

プロトコルの最も重要なステッ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL conical tube	fisher scientific	10203001
Adhesive PCR Plate Seals	Thermo Fisher Scientific	AB0558
Amplicon Tagment Mix (ATM)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A 63881
Betaine	Sigma-Aldrich	61962
Cell culture grade 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	260860
Cell culture vacuum pump (VACUSAFE)	Integra Bioscience	158300
Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each	Fermentas	R0192
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
DTT (100 mM)	Invitrogen	18064-014
EDTA	Sigma-Aldrich	798681	for adherent cells
Ethanol	Sigma-Aldrich	51976
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	26140079
Filter tips (10 µL)	Gilson	F171203
Filter tips (100 µL)	Gilson	F171403
Filter tips (20 µL)	Gilson	F171303
Filter tips (200 µL)	Gilson	F171503
Guanidine Hydrochloride	Sigma-Aldrich	G3272
ISPCR primer (10 µM)	Biomers.net GmbH	SP10006	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)	KAPA Biosystems	KK2601
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Magnetic stand 96	Ambion	AM10027
Neutralize Tagment (NT) Buffer	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS
Nextera-compatible indexing primer	Illumina
Nuclease-free water	Invitrogen	10977049
PBS	Thermo Fisher Scientific	AM9624
PCR 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	AB0600
PCR plate sealer	Thermo Fisher Scientific	HSF0031
Penicillin / Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15070063
Qubit 4 fluorometer	Invitrogen	15723679
Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul)	TAKARA	2313A
RPMI-1640 cell culture medium	Gibco	61870036	If not working with PBMCs, adjust to cell type
SMART dT30VN primer	Sigma-Aldrich		5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3
Standard lab equipment	various	various	e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
Tagment DNA Buffer (TD)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
TapeStation system 4200	Agilent	G2991BA
Thermocycler (S1000)	Bio-Rad	1852148
TSO-LNA (100 uM)	Eurogentec		5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G
Vortex-Genie 2 Mixer	Sigma-Aldrich	Z258415