費用対効果の高いトランスクリプトームベースの薬物スクリーニング

要約

このプロトコルは費用効果が大きいトランスクリプトーム ベースの薬剤のスクリーニングのためのex 生体内 または 生体外の 細胞培養からのトランスクリプトーム データ前処理へのワークフローを記述する。

要約

トランスクリプトミクスは、細胞プログラムとその摂動に対する応答に関する包括的な洞察を得ることができます。過去10年間でライブラリーの作製とシーケンシングのコストが大幅に低下したにもかかわらず、これらの技術を薬物スクリーニングに必要な規模で適用することは依然として法外なコストがかかり、これらの方法の計り知れない可能性を妨げています。本研究は、小型の摂動培養とミニバルクトランスクリプトミクスを組み合わせた、トランスクリプトームベースの薬物スクリーニングのための費用対効果の高いシステムを提示しています。最適化されたミニバルクプロトコルは、費用対効果の高いシーケンシング深度で有益な生体シグナルを提供し、既知の薬物や新しい分子の広範なスクリーニングを可能にします。選択した治療とインキュベーション時間に応じて、このプロトコルは約2日以内にライブラリのシーケンシングになります。このプロトコル内にはいくつかの停止ポイントがあるため、ライブラリ調製とシーケンシングは時間に依存しない状態で行うことができます。多数のサンプルを同時に処理することが可能です。最大384サンプルの測定は、データ品質を損なうことなくテストされました。また、最適な薬物インキュベーション時間のばらつきを考慮しているにもかかわらず、条件および/または薬物の数に既知の制限はありません。

概要

新薬の開発は、候補となる医薬品とその標的の特定、医薬品候補の最適化と合成、前臨床試験および臨床試験での有効性と安全性の検証を含む、複雑で時間のかかるプロセスです¹。従来の薬物スクリーニングの方法、すなわち治療目的で候補化合物のライブラリーを系統的に評価する方法では、動物モデルまたは細胞ベースのアッセイを使用して、特定の標的または経路に対する効果を試験します。これらの手法は、医薬品候補の同定には成功していますが、薬効の根底にある複雑な分子メカニズムや、毒性、潜在的な副作用のメカニズムについては、十分な洞察が得られないことが多かったのです。

ゲノムワイドな転写状態を評価することは、薬物治療に反応した遺伝子発現の包括的な評価を可能にするため、薬物スクリーニングにおける現在の限界を克服するための強力なアプローチを提示します²。トランスクリプトミクスは、ある時点で発現するRNA転写産物をゲノムワイドに測定することにより、遺伝子発現パターン、選択的スプライシング、ノンコーディング^{RNA発現の変化}など、薬物に反応して起こる転写変化の全体像を提供することを目的としています3。この情報は、薬物標的の決定、薬物の有効性と毒性の予測、薬物の投与と治療計画の最適化に使用できます。

トランスクリプトミクスと偏りのない薬物スクリーニングを組み合わせることの主な利点の1つは、これまで考慮されていなかった新しい薬剤標的を特定できる可能性があることです。従来の薬物スクリーニングアプローチは、確立された標的分子や経路に焦点を当てることが多く、新しい標的の同定を妨げ、予期せぬ副作用や有効性が制限される薬剤につながる可能性があります。トランスクリプトミクスは、薬物治療に反応して起こる分子変化に関する洞察を提供し、これまで考慮されていなかった可能性のある潜在的な標的や経路を明らかにすることで、これらの限界を克服することができます²。

トランスクリプトミクスは、新しい創薬標的の同定に加えて、薬効や毒性の予測にも使用できます。薬物応答に関連する遺伝子発現パターンを解析することにより、特定の薬物または治療レジメンに対する患者の反応を予測するために使用できるバイオマーカーを開発することができます。これは、薬剤の投与量を最適化し、有害な副作用のリスクを軽減するのにも^{役立ちます4。}

トランスクリプトミクスの潜在的な利点にもかかわらず、薬物スクリーニングにおけるトランスクリプトミクスの広範な適用に対する大きな障壁は依然として存在しています。トランスクリプトーム解析には特殊な機器、技術的専門知識、データ解析が必要であり、小規模な研究チームや資金が限られている組織では、薬物スクリーニングにトランスクリプトミクスを利用することが困難な場合があります。しかし、トランスクリプトミクスのコストは着実に低下しており、研究コミュニティにとってより身近なものとなっています。さらに、技術とデータ解析方法の進歩により、トランスクリプトミクスはより効率的で費用対効果が高くなり、アクセシビリティがさらに向上しました²。

このプロトコルでは、ミニチュア化された摂動培養とミニバルクトランスクリプトミ^{クス分析を組み合わせた}、トランスクリプトームベースの薬物スクリーニングのための高次元で探索的なシステムについて説明します^5,6。このプロトコルにより、サンプルあたりのコストを、完全長mRNAシーケンシングの市販ソリューションの現在のコストの1/6に削減することが可能です。このプロトコルは、標準的な実験装置のみを必要とし、唯一の例外はショートリードシーケンシング技術の使用であり、シーケンシング機器が社内にない場合はアウトソーシングすることができます。最適化されたミニバルクプロトコルは、費用対効果の高いシーケンシング深度で情報量の多い生体シグナルを提供し、既知の薬物や新しい分子の広範なスクリーニングを可能にします。

この実験の目的は、さまざまな生物学的状況におけるPBMCの薬物活性をスクリーニングすることです。このプロトコルは、複数の薬剤をトランスクリプトーム読み出しでテストし、治療の細胞効果をトランスクリプトーム全体で把握できる生物学的問題に適用できます。

プロトコル

このプロトコルは、ボン大学の地元の倫理委員会のガイドラインに従います。

1. 緩衝液、溶液、装置の調製

1. 溶液を調製し、 材料表に記載されている材料を収集します。
2. ウォーターバスを37°Cに加熱し、完全な増殖培地(RPMI-1640 + 10%ウシ胎児血清(FCS)+ 1%ペニシリン/ストレプトマイシン)を温めます。
3. 細胞回収には、氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用します。
   注:細胞を操作している間は、無菌性を維持するために清潔な環境を保ちます。

2. 細胞の取り扱い

注:ヒト血液からの末梢血単核球(PBMC)の凍結保存に関する詳細なプロトコルは、⁷に記載されています。

1. 細胞の融解とカウント
   1. 液体窒素からクライオバイアルを取り出し、37°Cのウォーターバスで2〜3分間、静かに反転させながら解凍します。
   2. 融解した細胞を50 mLのコニカルチューブに移します。
   3. クライオバイアルを1 mLの温かい完全増殖培地ですすぎ、この溶液をチューブ内の細胞に滴下します(^1回目の 希釈ステップ)。
   4. 32 mL(それぞれ1、2、4、8、および16 mLの温かい完全増殖培地で合計5回の希釈)に達するまで、希釈を1:1で繰り返します。培地を滴下して、コニカルチューブをわずかに攪拌しながら細胞の乱れを減らします。
   5. 細胞懸濁液を5分間遠心分離し(300 x g、20°C)、コニカルチューブを1回流暢に傾けて上清を除去します。
   6. 細胞を3 mLの温かい完全増殖培地に再懸濁し、細胞計数に進みます。
   7. カウントには、10 μLの細胞懸濁液をトリパンブルー(細胞懸濁液の密度に応じて1:2〜1:10の希釈)と混合して、カウント中に生細胞と死細胞を区別します。死んだ細胞や損傷した細胞は、色素の取り込みにより青く見えますが、重要な細胞は染色されません。
      注:トリパンブルーはわずかに細胞毒性があるため、染色された細胞は5分以上保存しないでください。
   8. 自動セルカウンターまたは10 μLの染色細胞溶液を使用してカウントチャンバーで細胞をカウントします。
      1. ノイバウアー改良セルチャンバーを使用する場合は、四隅にある4つの大きな正方形内のすべての細胞をカウントし、次の式を使用して細胞懸濁液の濃度を計算します。
         
   9. 細胞を温かい完全増殖培地で最終濃度1 x 10⁶ cells/mLに希釈します。必要な容量が3 mL未満の場合にのみ遠心分離し、細胞ペレットを適切な容量に再懸濁します。
2. 細胞の播種と処理
   1. 1ウェルあたり100μLの細胞懸濁液を96ウェル細胞培養プレート(1 x 10⁵ 細胞/ウェル)に播種します。
      注:播種用の細胞数は、PBMC 培養用に最適化しました。細胞濃度が低いと、シーケンシングに十分な量のRNAが得られませんが、細胞数が多すぎると、細胞溶解が最適でなくなり、逆転写反応が阻害されるリスクが高まります。
   2. 治療に使用した濃度の2倍(2倍)の濃度で薬物希釈液を調製します。化合物の溶解度に応じて溶媒を選択し、好ましくは完全増殖培地を選択します。
      注:PBSまたはジメチルスルホキシド(DMSO)は、他の方法では十分な溶解度が得られない場合は使用できます。得られたインキュベーション容量中のDMSOの最大濃度は、溶媒によって誘発される細胞毒性を防ぐために0.5%を超えてはなりません。
   3. 100 μL の薬物希釈液(ウェル 1X の最終濃度)を加え、37 °C で規定の時間インキュベートします。
      注:最適な薬物インキュベーション時間を確立し、細胞毒性の潜在的なメカニズムを排除するために、補完的な調査を実施する必要があります。.
3. 細胞回収と溶解
   1. 細胞培養プレートを10分間遠心分離します(300 x g、20°C)。プレートを斜め(30°〜45°)に保ちながら、チップをウェルの低い角に向けながら、真空ポンプで上清を静かに除去し、細胞をできるだけ少なくします。
   2. 各ウェルに200 μLの氷冷PBSを添加して細胞を洗浄し、プレートを5分間遠心分離します(300 x g、4°C)。真空ポンプで上清を除去し、プレートを鋭角に保ち、PBSをできるだけ多く除去します。
   3. 必要な反応数(rxn)について、 表1 に記載の溶解緩衝液を調製し、10%の過剰分を加えます。
   4. 各ウェルに15 μLの溶解バッファーを添加し、プレートを粘着シーリングフィルムで密封して、サンプルを汚染から保護します。1分間(1000 x g、4°C)遠心分離する前にプレートをボルテックスし、氷上で5分間インキュベートします。
   5. 溶解した細胞溶液6 μLをPCRプレートに回収し、細胞溶解液を-80°Cで短時間凍結して、最適な細胞溶解を確保します。プレートの複数の凍結サイクルは避けてください。
      注:停止ポイント:その後、cDNA産生が行われない場合、細胞ライセートはRNA品質を大幅に低下させることなく、最大数か月間-80°Cで保存できます。

3. シーケンシングのためのライブラリ調製

1. 逆転写酵素(RT)反応
   注:RNAを扱う場合は、すべてのサンプルを氷上に置き、ヌクレアーゼフリーの機器(滅菌済みの使い捨てプラスチック製品)と水を必ず使用してください。
   1. 表 2 に記載のとおりに、必要な反応数に合わせて RT 反応ミックスを調製し、10% の過剰分を加えます。ミックスを短時間ボルテックスし、すぐにスピンダウンします。使用するまで、ミックスを氷の上に置いてください。
   2. 細胞ライセートを室温(RT)で融解し、短時間スピンダウンして、すべての細胞ライセートをプレートの底部に回収します。
   3. 表3に従ってサーモサイクラーでmRNA変性を行います。
   4. サーモサイクラーからプレートを取り出し、すぐに回転させて潜在的な凝縮液を収集します。各ウェルに6 μLのRT反応ミックスを添加し、最終容量が12 μLになるようにします。 プレートを保護し、蒸発や渦を避けるためにプレートを密封し、スピンダウンさせます。
   5. プレートをサーモサイクラーに置き、 表3に従ってRT反応プログラムを開始します。
2. プリアンプ
   1. ハイフィデリティDNAポリメラーゼおよび in-situ PCR(ISPCR)プライマーを室温で融解します。
   2. 必要な反応数について、 表 4 に従ってプレ増幅ミックスを調製し、10% の過剰分を加えます。ミックスを短時間ボルテックスしてスピンダウンします。
      注:酵素ミックスは室温で数時間安定しています。
   3. PCRプレートをスピンダウンし、各ウェルに15 μLのプレアンプミックスを添加し、プレートを密封します。
   4. それをサーモサイクラーに置き、 表5に従って予備増幅反応を開始します。
      1. RNA含有量によるサイクル数を調整します。低い数値から始めて、cDNA収量が十分でない場合は増やします。
         注:私たちの経験では、細胞の種類ごとに最適なサイクル数を確立する必要があり、実験条件と処理は最適なサイクル数に影響を与えません。したがって、新しい細胞タイプに対してこのプロトコルを確立する際には、最適なサイクル数を実験的に確立することをお勧めします。一般に、初代細胞は細胞株と比較してより多くのサイクル数を必要とします。停止点:プリアンプ製品は-20°Cで保存できます。
3. cDNAのクリーンアップと品質管理(QC)
   注:サンプルのクリーンアップは、この段階ではサンプルがかなり安定しているため、プレートごとに順番に実行できます。サンプル数を増やすと、プロトコルの期間が長くなりますが、同時に処理できるサンプルの数は制限されません。
   1. 開始する前に、磁気精製ビーズを室温に戻し、高速で1分間ボルテックスして、ビーズを完全に再懸濁します。
   2. 0.8 v/v(20 μL)の磁気精製ビーズを各ウェルに添加し、室温で5分間インキュベートします。
   3. ビーズが完全に分離されるまで、PCRプレートを磁気ラックに5分間置きます。上澄みを慎重に取り除きます。
   4. プレートを磁気ラックに置いたまま、調製したばかりの80%エタノール100 μLを静かに加えてビーズを洗浄し、30秒間インキュベートします。少量のピペットを使用して上清を除去します。追加の洗浄ステップについても繰り返します。エタノールはできるだけ除去してください。
   5. 磁気ラック上のビーズを室温で最大5分間風乾し、エタノールが完全に蒸発し、ビーズが光沢がなくなるまで乾燥させます。
   6. プレートを磁気ラックから取り出し、ビーズを20 μLのヌクレアーゼフリー水に再懸濁し、2分間インキュベートします。
   7. ビーズが分離するまで、プレートを磁気ラックに再度置きます。
   8. cDNA QCおよびタグメンテーション用の新しいPCRプレートで溶出液を回収します。
   9. TapeStation または FragmentAnalyser アッセイを実施して、cDNA ライブラリーのサイズ分布と濃度を評価します (推奨: TapeStation D5000 アッセイ)。詳しくは、製造元の指示をご覧ください。20 ngの典型的な収量が期待されます。
4. キットによるタグメンテーション
   注:すでに確立されている場合は、他のタグメンテーションプロトコルを使用できます。
   1. ヌクレアーゼフリーの水を使用して、cDNAを最終濃度150〜300pg/μLに希釈します。
   2. 表6に従ってサーモサイクラーを事前にプログラムし、酵素ミックスにcDNAを添加した後、タグメンテーション反応を直ちに開始します。
   3. 必要な反応数について、 表 7 に従ってタグメンテーションミックスを調製し、10% の過剰分を加えます。
   4. 反応ごとに3 μLのタグメンテーションミックスを新しいPCRプレートに分注し、各反応に1 μLのcDNAを加えます。
   5. cDNAを添加した直後にタグメンテーション反応を開始します。
   6. 1 μLの中和タグメントバッファー(NT;または0.2%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS))を使用して反応を不活性化します。
5. 濃縮PCR
   1. 濃縮PCRミックス( 表7 )を反応数用に調製し、10%過剰分を加えます。(推奨:パターン化されたフローセル(例:Illumina NovaSeq 6000)のインデックスホッピングを防止するように設定されたNextera UDI)。
   2. 各反応液に9 μLの濃縮PCRミックスを添加し、総容量を14 μLにします。
   3. 表8に従って濃縮PCRプログラムを実行します。
      注:濃縮PCRの場合、16サイクルが標準です。cDNAの品質が悪い場合は、サイクルを追加することができます。
6. クリーンアップとQC
   1. 開始する前に、磁気精製ビーズを室温に戻し、高速で1分間ボルテックスして、ビーズを完全に再懸濁します。
   2. 1.0x v/v(14 μL)の磁気精製ビーズを加え、室温で5分間インキュベートします。
   3. プレートを磁気ラックに置き、ビーズが完全に分離するまで5分間待ちます。上澄みを慎重に取り除きます。
   4. プレートを磁気ラックに置いたまま、調製したばかりの80%エタノール100 μLを静かに加えてビーズを洗浄し、30秒間インキュベートします。少量のピペットを使用して上清を除去します。追加の洗浄ステップについても繰り返します。エタノールはできるだけ除去してください。
   5. ビーズを室温で3分間、または光沢がなくなるまで風乾します。
   6. プレートを磁気ラックから取り出し、ビーズを20 μLのヌクレアーゼフリー水に再懸濁し、2分間インキュベートします。
   7. ビーズが分離するまでプレートを磁気ラックに再度置き、ライブラリQC用の新しいPCRプレートで溶出液を回収します。
   8. TapeStation または Fragment Analyzer アッセイを実施して、cDNA ライブラリーのサイズ分布と濃度を評価します (推奨:TapeStation D1000 高感度アッセイ)。詳しくは、製造元の指示をご覧ください。平均して、10ngの収量が期待されます。
      注:停止点:PCR産物は-20°Cで保存できます。

4. シーケンシングとデータの前処理

1. シークエンシング
   注:以下のガイドラインは、ショートリードシーケンシング用のすべてのIllumina機器に適用されます。計測器が利用できない場合は、外部のシーケンシング機能でシーケンシングを実行できます。他のシーケンシングアプローチも使用できます。わかりやすくするために、最も広く使用されているシーケンシング技術のみについて報告することにしました。
   注:ソフトウェアの使用に関連する次の手順では、Illumina NovaSeq6000シーケンサーでの手順について説明します。
   1. 一意にインデックス付けされたライブラリを、手順 3.6.8 で得られた結果に従って等モル比でプールします。
   2. 高感度アッセイで最終プールの濃度を測定し、サンプルのモル濃度を次のように計算します。
      
   3. 装置の仕様と実験的最適化に従ってフローセルに負荷をかけます。一般的な機器の負荷量濃度の例を 表 9 に示します。
   4. 画面をタッチして [シーケンス ] を選択し、実行のセットアップを開始します。
   5. 画面とロードフローセル、合成シーケンスカートリッジ、クラスタリングカートリッジ、バッファーカートリッジの指示に従い、廃液容器が空であることを確認します。
   6. すべての試薬が装置によって認識されたら、 Run Setupをクリックします。ここでは、実行名とデータを格納する出力フォルダーを定義します。
   7. シーケンシングの詳細を、両方のリードが 51 bp のペアエンドとして定義します。また、2 つのインデックス読み取りもそれぞれ 8 bp でシーケンスされます。
   8. [確認]を押し、すべてのシーケンスの詳細が正しいことを確認した後、[実行の開始]を押します。
      注:推奨されるシーケンシング深度は 5 x 10⁶ リード/サンプルで、最小 1 x 10⁶ リード/サンプルです。
2. データの前処理
   1. 生のシーケンシングデータをFASTQ形式に変換し、Bcl2Fastq2ツールを使用してサンプルインデックスに従って逆多重化します。デフォルト設定で逆多重化を実行します。Bcl2Fastq2 の詳細な手順については、リファレンス マニュアルを参照してください。
      注:FASTQの変換と逆多重化は、シーケンシングが社内で行われない場合、通常、シーケンシング施設によって実行されます。シーケンシング施設は、通常、さらなる処理のために逆多重化されたFASTQを提供します。
   2. シーケンシングリードのデータアライメントと存在量の定量には、いくつかのオプションが用意されています(推奨:nf-core RNA-seq pipeline (https://nf-co.re/rnaseq))。パイプラインにはいくつかのオプションがあり、STAR⁸ をアライメントし、Salmon⁹ をアライメントしたデフォルト設定を使用して、転写産物の存在量を定量化します。
   3. 注:さらなるバイオインフォマティクス分析には、いくつかの方法があります。このプロトコルでは、すべてを網羅するものではありません(推奨:DEseq2パイプライン¹⁰)。当社が開発したDEseq2ワークフローに基づく標準スクリプトは、GitHub(https://github.com/jsschrepping/RNA-DESeq2)にあります。

結果

報告されたプロトコルに従って、ヒトPBMCを播種し、異なる免疫調節薬で処理し、異なるインキュベーション時間後に、シーケンシングプロトコルを用いたバルクトランスクリプトーム解析のために回収しました(図1)。

試験化合物の理想的な薬物濃度とインキュベーション時間は、補完的な実験戦略の助けを借りて、特定の科学的質問に基づいて、?...

ディスカッション

創薬や創薬は、バルクトランスクリプトミクスが提供できる細胞プロセスの全体像から大きな恩恵を受けることができます。しかし、このアプローチは、標準的なバルクRNA-seqプロトコルを用いた実験のコストが高いため、学術的な環境での応用が妨げられることや、産業的なスケーラビリティの可能性が妨げられることが多くあります。

プロトコルの最も重要なステッ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL conical tube	fisher scientific	10203001
Adhesive PCR Plate Seals	Thermo Fisher Scientific	AB0558
Amplicon Tagment Mix (ATM)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A 63881
Betaine	Sigma-Aldrich	61962
Cell culture grade 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	260860
Cell culture vacuum pump (VACUSAFE)	Integra Bioscience	158300
Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each	Fermentas	R0192
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
DTT (100 mM)	Invitrogen	18064-014
EDTA	Sigma-Aldrich	798681	for adherent cells
Ethanol	Sigma-Aldrich	51976
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	26140079
Filter tips (10 µL)	Gilson	F171203
Filter tips (100 µL)	Gilson	F171403
Filter tips (20 µL)	Gilson	F171303
Filter tips (200 µL)	Gilson	F171503
Guanidine Hydrochloride	Sigma-Aldrich	G3272
ISPCR primer (10 µM)	Biomers.net GmbH	SP10006	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)	KAPA Biosystems	KK2601
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Magnetic stand 96	Ambion	AM10027
Neutralize Tagment (NT) Buffer	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS
Nextera-compatible indexing primer	Illumina
Nuclease-free water	Invitrogen	10977049
PBS	Thermo Fisher Scientific	AM9624
PCR 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	AB0600
PCR plate sealer	Thermo Fisher Scientific	HSF0031
Penicillin / Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15070063
Qubit 4 fluorometer	Invitrogen	15723679
Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul)	TAKARA	2313A
RPMI-1640 cell culture medium	Gibco	61870036	If not working with PBMCs, adjust to cell type
SMART dT30VN primer	Sigma-Aldrich		5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3
Standard lab equipment	various	various	e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
Tagment DNA Buffer (TD)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
TapeStation system 4200	Agilent	G2991BA
Thermocycler (S1000)	Bio-Rad	1852148
TSO-LNA (100 uM)	Eurogentec		5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G
Vortex-Genie 2 Mixer	Sigma-Aldrich	Z258415