בדיקת תרופות מבוססת תמלול חסכונית

Summary

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה מתרביות תאים ex vivo או in vitro לעיבוד מקדים של נתוני תמלול לסינון תרופות מבוסס תמלול חסכוני.

Abstract

תמלול מאפשר לקבל תובנות מקיפות על תוכניות סלולריות ותגובותיהן להפרעות. למרות ירידה משמעותית בעלויות הייצור והריצוף של ספריות בעשור האחרון, יישום טכנולוגיות אלה בהיקף הדרוש לסינון תרופות נותר יקר מאוד, וחוסם את הפוטנציאל העצום של שיטות אלה. המחקר שלנו מציג מערכת חסכונית לבדיקת תרופות מבוססת תמלול, המשלבת תרביות הפרעה ממוזערות עם מיני-תמלול בתפזורת. פרוטוקול המיני-צובר הממוטב מספק אותות ביולוגיים אינפורמטיביים בעומק ריצוף חסכוני, ומאפשר סינון נרחב של תרופות ידועות ומולקולות חדשות. בהתאם לזמן הטיפול והדגירה שנבחר, פרוטוקול זה יביא לספריות רצף תוך כיומיים. בשל מספר נקודות עצירה בפרוטוקול זה, הכנת הספרייה, כמו גם הרצף, יכולים להתבצע ללא תלות בזמן. עיבוד בו זמנית מספר גבוה של דגימות אפשרי; מדידה של עד 384 דגימות נבדקה ללא אובדן איכות הנתונים. כמו כן, לא ידועות מגבלות על מספר המצבים ו/או התרופות, למרות שלוקחים בחשבון את השונות בזמני הדגירה האופטימליים של התרופה.

Introduction

פיתוח תרופות חדשות הוא תהליך מורכב וגוזל זמן הכולל זיהוי תרופות פוטנציאליות ומטרותיהן, אופטימיזציה וסינתזה של תרופות מועמדות ובדיקת יעילותן ובטיחותן בניסויים פרה-קליניים וקליניים¹. שיטות מסורתיות לסינון תרופות, כלומר, הערכה שיטתית של ספריות של תרכובות מועמדות למטרות טיפוליות, כוללות שימוש במודלים של בעלי חיים או בדיקות מבוססות תאים כדי לבחון את ההשפעות על מטרות או מסלולים ספציפיים. בעוד ששיטות אלה הצליחו לזהות מועמדים לתרופה, לעתים קרובות הן לא סיפקו תובנות מספקות לגבי המנגנונים המולקולריים המורכבים העומדים בבסיס יעילות התרופה וגם רעילות ומנגנונים של תופעות לוואי אפשריות.

הערכת מצבי שעתוק כלל גנומיים מציגה גישה רבת ע....

Protocol

פרוטוקול זה עוקב אחר הנחיות ועדות האתיקה המקומיות של אוניברסיטת בון.

1. הכנת חוצצים, פתרונות וציוד

1. הכן את הפתרונות ואסוף את החומרים המתוארים בטבלת החומרים.
2. חממו את אמבט המים ל-37°C וחממו את מדיום הגידול המלא (RPMI-1640 + 10% סרום עגל עוברי (FCS) + 1% פניצילין/סטרפטומיצין).
3. לקצירת תאים, השתמשו במי מלח חוצצי פוספט קר כקרח (PBS).
   הערה: שמור על סביבה נקייה בעת עבודה עם תאים כדי לשמור על סטריליות.

2. טיפול בתאים

הערה: פרוטוקול מפורט לשימור בהקפאה של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMC) מדם אנושי ניתן למצוא<....

תוצאות

בעקבות הפרוטוקול המדווח, PBMCs אנושיים נזרעו, טופלו בתרופות אימונומודולטוריות שונות, ולאחר זמני דגירה שונים, נקטפו לצורך ניתוח שעתוק בתפזורת באמצעות פרוטוקול הריצוף (איור 1).

יש לזהות ריכוזי תרופות אידיאליים וזמני דגירה של תרכובות בדיקה במעלה הזרם פרוטוקול זה.......

Discussion

גילוי תרופות ופיתוח תרופות יכולים להפיק תועלת רבה מהראייה ההוליסטית של תהליכים תאיים שתעתיק בתפזורת יכול לספק. עם זאת, גישה זו מוגבלת לעתים קרובות על ידי העלות הגבוהה של הניסוי עם פרוטוקול RNA-seq סטנדרטי בתפזורת, האוסר על יישומו במסגרות אקדמיות, כמו גם הפוטנציאל שלו למדרגיות תעשייתית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL conical tube	fisher scientific	10203001
Adhesive PCR Plate Seals	Thermo Fisher Scientific	AB0558
Amplicon Tagment Mix (ATM)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A 63881
Betaine	Sigma-Aldrich	61962
Cell culture grade 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	260860
Cell culture vacuum pump (VACUSAFE)	Integra Bioscience	158300
Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each	Fermentas	R0192
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
DTT (100 mM)	Invitrogen	18064-014
EDTA	Sigma-Aldrich	798681	for adherent cells
Ethanol	Sigma-Aldrich	51976
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	26140079
Filter tips (10 µL)	Gilson	F171203
Filter tips (100 µL)	Gilson	F171403
Filter tips (20 µL)	Gilson	F171303
Filter tips (200 µL)	Gilson	F171503
Guanidine Hydrochloride	Sigma-Aldrich	G3272
ISPCR primer (10 µM)	Biomers.net GmbH	SP10006	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)	KAPA Biosystems	KK2601
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Magnetic stand 96	Ambion	AM10027
Neutralize Tagment (NT) Buffer	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS
Nextera-compatible indexing primer	Illumina
Nuclease-free water	Invitrogen	10977049
PBS	Thermo Fisher Scientific	AM9624
PCR 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	AB0600
PCR plate sealer	Thermo Fisher Scientific	HSF0031
Penicillin / Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15070063
Qubit 4 fluorometer	Invitrogen	15723679
Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul)	TAKARA	2313A
RPMI-1640 cell culture medium	Gibco	61870036	If not working with PBMCs, adjust to cell type
SMART dT30VN primer	Sigma-Aldrich		5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3
Standard lab equipment	various	various	e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
Tagment DNA Buffer (TD)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
TapeStation system 4200	Agilent	G2991BA
Thermocycler (S1000)	Bio-Rad	1852148
TSO-LNA (100 uM)	Eurogentec		5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G
Vortex-Genie 2 Mixer	Sigma-Aldrich	Z258415