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비용 효율적인 전사체 기반 약물 스크리닝
요약
이 프로토콜은 비용 효율적인 전사체 기반 약물 스크리닝을 위해 체외 또는 체외 세포 배양에서 전사체 데이터 전처리까지의 워크플로우를 설명합니다.
초록
전사체학을 통해 세포 프로그램과 섭동에 대한 반응에 대한 포괄적인 통찰력을 얻을 수 있습니다. 지난 10년 동안 라이브러리 생산 및 염기서열 분석 비용이 크게 감소했음에도 불구하고 약물 스크리닝에 필요한 규모로 이러한 기술을 적용하는 것은 여전히 엄청난 비용이 들기 때문에 이러한 방법의 엄청난 잠재력을 가로막고 있습니다. 우리의 연구는 소형화된 섭동 배양과 미니 벌크 전사체학을 결합한 전사체 기반 약물 스크리닝을 위한 비용 효율적인 시스템을 제시합니다. 최적화된 mini-bulk 프로토콜은 비용 효율적인 염기서열분석 깊이에서 유익한 생물학적 신호를 제공하여 알려진 약물 및 새로운 분자에 대한 광범위한 스크리닝을 가능하게 합니다. 선택한 처리 및 배양 시간에 따라 이 프로토콜은 약 2일 이내에 시퀀싱 라이브러리를 생성합니다. 이 프로토콜 내의 여러 중지 지점으로 인해 라이브러리 준비와 염기서열분석은 시간에 관계없이 수행할 수 있습니다. 많은 수의 샘플을 동시에 처리할 수 있습니다. 최대 384개의 샘플 측정이 데이터 품질 손실 없이 테스트되었습니다. 또한 최적의 약물 배양 시간의 변동성을 고려했음에도 불구하고 조건 및/또는 약물의 수에 대한 알려진 제한은 없습니다.
서문
신약 개발은 잠재적 약물과 표적을 식별하고, 약물 후보를 최적화 및 합성하고, 전임상 및 임상 시험에서 효능과 안전성을 테스트하는 복잡하고 시간이 많이 소요되는 프로세스입니다1. 약물 스크리닝을 위한 전통적인 방법, 즉 치료 목적을 위한 후보 화합물 라이브러리의 체계적인 평가에는 특정 표적 또는 경로에 대한 효과를 테스트하기 위해 동물 모델 또는 세포 기반 분석을 사용하는 것이 포함됩니다. 이러한 방법은 약물 후보를 식별하는 데 성공적이었지만 약물 효능의 기초가 되는 복잡한 분자 메커니즘과 잠재적 부작용의 독성 및 메커니즘에 대한 충분한 통찰력을 제공하지 못하는 경우가 많았습니다.
게놈 전반의 전사 상태를 평가하는 것은 약물 치료에 대한 반응으로 유전자 발현을 포괄적으로 평가할 수 있기 때문에 현재 약물 스크리닝의 한계를 극복할 수 있는 강력한 접근 방식을 제시합니다2. 주어진 시간에 발현되는 게놈 전체 방식으로 RNA 전사체를 측정함으로써 전사체학은 유전자 발현 패턴의 변화, 선택적 스플라이싱 및 비코딩 RNA 발현 3을 포함하여 약물에 대한 반응에서 발생하는 전사 변화에 대한 전체적인 관점을 제공하는 것을 목표로 합니다3<....
프로토콜
이 프로토콜은 본 대학교의 지역 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.
1. 완충액, 용액 및 장비 준비
- 용액을 준비하고 재료 목차에 설명된 재료를 수집합니다.
- 수조를 37°C로 가열하고 완전 성장 배지(RPMI-1640 + 10% 태아 송아지 혈청(FCS) + 1% 페니실린/스트렙토마이신)을 예열합니다.
- 세포 채취의 경우 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)를 사용합니다.
알림: 무균 상태를 유지하기 위해 세포와 함께 작업하는 동안 깨끗한 환경을 유지하십시오.
2. 세포 취급
참고: 인간 혈액에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 동결 보존을 위한 자세한 프로토콜은7에서 찾을 수 있습니다.
- 세포 해동 및 계수
- 액체 질소에서 극저온을 제거하고 37°C의 수조에서 2 - 3분 동안 부드럽게 뒤집으면서 해동합니다.
- 해동된 세포를 50mL 원뿔형 튜브에 옮깁니다.
- 1mL의 따뜻한 ....
대표적 결과
보고된 프로토콜에 따라 인간 PBMC를 파종하고, 다양한 면역조절 약물로 처리하고, 서로 다른 배양 시간 후에 염기서열분석 프로토콜을 사용하여 대량 전사체 분석을 위해 수확했습니다(그림 1).
테스트 화합물에 대한 이상적인 약물 농도 및 배양 시간은 보완적인 실험 전략의 도움과 특정 과학적 질문을 기반으로 이 프로토콜의 업스트림에서 식별되어야.......
토론
약물 발견 및 약물 개발은 벌크 전사체학이 제공할 수 있는 세포 과정에 대한 전체론적 관점으로부터 큰 이점을 얻을 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 이 접근법은 표준 벌크 RNA-seq 프로토콜을 사용한 실험의 높은 비용으로 인해 제한되는 경우가 많으며, 이는 학술 환경에서의 적용과 산업 확장성 가능성을 금지합니다.
프로토콜의 가장 중요한 단계는 세포 해동과 라이브러리.......
공개
저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 말
JLS는 독일의 우수성 전략(EXC2151-390873048)과 SCHU 950/8-1에 따라 독일 연구 재단(DFG)의 지원을 받습니다. GRK 2168, TP11; CRC SFB 1454 Metaflammation, IRTG GRK 2168, WGGC INST 216/981-1, CCU INST 217/988-1, BMBF 자금 지원 우수 프로젝트 Diet-Body-Brain (DietBB); 및 보조금 번호 733100에 따른 EU 프로젝트 SYSCID. M.B.는 DFG에서 지원됩니다(IRTG2168-272482170, SFB1454-432325352). L.B.는 DFG(ImmuDiet BO 6228/2-1 - 프로젝트 번호 513977171) 및 Germany's Excellence Strategy(EXC2151-390873048)의 지원을 받습니다. BioRender.com 로 만든 이미지.
....자료
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conical tube | fisher scientific | 10203001 | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Thermo Fisher Scientific | AB0558 | |
| Amplicon Tagment Mix (ATM) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A 63881 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 61962 | |
| Cell culture grade 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 260860 | |
| Cell culture vacuum pump (VACUSAFE) | Integra Bioscience | 158300 | |
| Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each | Fermentas | R0192 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| DTT (100 mM) | Invitrogen | 18064-014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | for adherent cells |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 51976 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Filter tips (10 µL) | Gilson | F171203 | |
| Filter tips (100 µL) | Gilson | F171403 | |
| Filter tips (20 µL) | Gilson | F171303 | |
| Filter tips (200 µL) | Gilson | F171503 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | G3272 | |
| ISPCR primer (10 µM) | Biomers.net GmbH | SP10006 | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′ |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnetic stand 96 | Ambion | AM10027 | |
| Neutralize Tagment (NT) Buffer | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS |
| Nextera-compatible indexing primer | Illumina | ||
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10977049 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| PCR 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB0600 | |
| PCR plate sealer | Thermo Fisher Scientific | HSF0031 | |
| Penicillin / Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Qubit 4 fluorometer | Invitrogen | 15723679 | |
| Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul) | TAKARA | 2313A | |
| RPMI-1640 cell culture medium | Gibco | 61870036 | If not working with PBMCs, adjust to cell type |
| SMART dT30VN primer | Sigma-Aldrich | 5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3 | |
| Standard lab equipment | various | various | e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| Tagment DNA Buffer (TD) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| TapeStation system 4200 | Agilent | G2991BA | |
| Thermocycler (S1000) | Bio-Rad | 1852148 | |
| TSO-LNA (100 uM) | Eurogentec | 5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G | |
| Vortex-Genie 2 Mixer | Sigma-Aldrich | Z258415 |
참고문헌
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Yang, X., et al. High-throughput transcriptome profiling in drug and biomarker discovery.
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