Dépistage de drogues basé sur la transcriptomique rentable

Résumé

Ce protocole décrit un flux de travail allant des cultures cellulaires ex vivo ou in vitro au prétraitement des données transcriptomiques pour un criblage rentable de médicaments basés sur le transcriptome.

Résumé

La transcriptomique permet d’obtenir des informations complètes sur les programmes cellulaires et leurs réponses aux perturbations. Malgré une baisse significative des coûts de production et de séquençage des bibliothèques au cours de la dernière décennie, l’application de ces technologies à l’échelle nécessaire au criblage des médicaments reste prohibitive, ce qui entrave l’immense potentiel de ces méthodes. Notre étude présente un système rentable de criblage de médicaments basé sur le transcriptome, combinant des cultures de perturbation miniaturisées avec une transcriptomique mini-en vrac. Le protocole mini-bulk optimisé fournit des signaux biologiques informatifs à une profondeur de séquençage rentable, ce qui permet un criblage approfondi de médicaments connus et de nouvelles molécules. En fonction du traitement choisi et du temps d’incubation, ce protocole permettra d’obtenir des banques de séquençage dans un délai d’environ 2 jours. En raison de plusieurs points d’arrêt au sein de ce protocole, la préparation de la bibliothèque, ainsi que le séquençage, peuvent être effectués indépendamment du temps. Il est possible de traiter simultanément un grand nombre d’échantillons ; La mesure de jusqu’à 384 échantillons a été testée sans perte de qualité des données. Il n’y a pas non plus de limites connues au nombre d’affections et/ou de médicaments, malgré la prise en compte de la variabilité des temps d’incubation optimaux des médicaments.

Introduction

Le développement de nouveaux médicaments est un processus complexe et chronophage qui implique l’identification de médicaments potentiels et de leurs cibles, l’optimisation et la synthèse de candidats-médicaments, et le test de leur efficacité et de leur innocuité dans le cadre d’essais précliniques et cliniques¹. Les méthodes traditionnelles de criblage de médicaments, c’est-à-dire l’évaluation systématique de bibliothèques de composés candidats à des fins thérapeutiques, impliquent l’utilisation de modèles animaux ou de tests cellulaires pour tester les effets sur des cibles ou des voies spécifiques. Bien que ces méthodes aient permis d’ident....

Protocole

Ce protocole suit les directives des comités d’éthique locaux de l’Université de Bonn.

1. Préparation des tampons, des solutions et de l’équipement

1. Préparez les solutions et rassemblez les matériaux décrits dans le tableau des matériaux.
2. Chauffer le bain-marie à 37 °C et réchauffer le milieu de croissance complet (RPMI-1640 + 10 % de sérum de veau fœtal (FCS) + 1 % de pénicilline/streptomycine).
3. Pour le prélèvement de cellules, utilisez une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée.
   REMARQUE : Gardez un environnement propre lorsque vous travaillez avec des cellules....

Discussion

La découverte et le développement de médicaments peuvent grandement bénéficier de la vision holistique des processus cellulaires que la transcriptomique de masse peut fournir. Néanmoins, cette approche est souvent limitée par le coût élevé de l’expérience avec le protocole standard de séquençage de l’ARN en vrac, ce qui interdit son application dans les milieux académiques ainsi que son potentiel d’évolutivité industrielle.

Les étapes les plus critiques du protocole sont.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL conical tube	fisher scientific	10203001
Adhesive PCR Plate Seals	Thermo Fisher Scientific	AB0558
Amplicon Tagment Mix (ATM)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A 63881
Betaine	Sigma-Aldrich	61962
Cell culture grade 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	260860
Cell culture vacuum pump (VACUSAFE)	Integra Bioscience	158300
Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each	Fermentas	R0192
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
DTT (100 mM)	Invitrogen	18064-014
EDTA	Sigma-Aldrich	798681	for adherent cells
Ethanol	Sigma-Aldrich	51976
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	26140079
Filter tips (10 µL)	Gilson	F171203
Filter tips (100 µL)	Gilson	F171403
Filter tips (20 µL)	Gilson	F171303
Filter tips (200 µL)	Gilson	F171503
Guanidine Hydrochloride	Sigma-Aldrich	G3272
ISPCR primer (10 µM)	Biomers.net GmbH	SP10006	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)	KAPA Biosystems	KK2601
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Magnetic stand 96	Ambion	AM10027
Neutralize Tagment (NT) Buffer	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS
Nextera-compatible indexing primer	Illumina
Nuclease-free water	Invitrogen	10977049
PBS	Thermo Fisher Scientific	AM9624
PCR 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	AB0600
PCR plate sealer	Thermo Fisher Scientific	HSF0031
Penicillin / Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15070063
Qubit 4 fluorometer	Invitrogen	15723679
Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul)	TAKARA	2313A
RPMI-1640 cell culture medium	Gibco	61870036	If not working with PBMCs, adjust to cell type
SMART dT30VN primer	Sigma-Aldrich		5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3
Standard lab equipment	various	various	e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
Tagment DNA Buffer (TD)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
TapeStation system 4200	Agilent	G2991BA
Thermocycler (S1000)	Bio-Rad	1852148
TSO-LNA (100 uM)	Eurogentec		5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G
Vortex-Genie 2 Mixer	Sigma-Aldrich	Z258415