التسلل الزراعي القسري بالفراغ للتحول في النبات للنباتات المتمردة: الكاكاو كدراسة حالة

Summary

هنا ، نقدم البروتوكول الأول للتسلل الفراغي الموضعي للدراسات في الجسم الحي للتحول الوراثي للنباتات كبيرة الحجم. باستخدام هذه المنهجية ، حققنا لأول مرة التحول العابر للكاكاو بوساطة Agrobacterium في النبات.

Abstract

عابر في تحول النبات هو بديل سريع وفعال من حيث التكلفة للتحول الوراثي للنبات. تعتمد معظم بروتوكولات التحول في النبات على استخدام التحول بوساطة Agrobacterium. ومع ذلك ، فإن البروتوكولات المستخدمة حاليا موحدة للنباتات الصغيرة الحجم بسبب القيود المادية والاقتصادية لإخضاع النباتات كبيرة الحجم للمعالجة الفراغية. يقدم هذا العمل بروتوكولا فعالا للتسلل الزراعي الموضعي القائم على الفراغ المخصص للنباتات كبيرة الحجم. لتقييم فعالية الطريقة المقترحة ، اختبرنا استخدامها في نباتات الكاكاو ، وهي أنواع نباتية استوائية متمردة على التحول الجيني. سمح بروتوكولنا بتطبيق ما يصل إلى 0.07 ميجا باسكال فراغ ، مع التكرار ، على جزء جوي موضعي من أوراق الكاكاو ، مما يجعل من الممكن إجبار تسلل Agrobacterium إلى المساحات بين الخلايا للأوراق المرفقة. نتيجة لذلك ، حققنا عابر بوساطة Agrobacterium في تحويل النبات لأوراق الكاكاو المرفقة التي تعبر عن نظام مراسل RUBY. هذا هو أيضا أول Agrobacterium بوساطة في تحول النبات العابر للكاكاو. سيسمح هذا البروتوكول بتطبيق طريقة الترشيح الزراعي القائمة على الفراغ على الأنواع النباتية الأخرى ذات القيود المماثلة في الحجم ويفتح الباب أمام توصيف الجينات في النبات في الأنواع الخشبية الكبيرة الحجم المتمردة.

Introduction

تعد طرق التحول الوراثي للنبات ضرورية لاختبار الوظائف البيولوجية للجينات وهي مفيدة بشكل خاص اليوم نظرا للعدد الكبير من الجينات غير المميزة المتوقعة في عصر ما بعد الجينوم¹. يمكن استخدام هذه الطرق للحصول على خطوط محولة بالكامل أو للتعبير عن الجينات بشكل عابر. يحدث التحول المستقر عندما يصبح الحمض النووي الأجنبي الذي تناوله المضيف مدمجا بشكل كامل ولا رجعة فيه في جينوم المضيف ، ويتم نقل التعديلات الجينية إلى الأجيال اللاحقة. يحدث التعبير العابر ، المعروف باسم التحول العابر ، من النسخ المتعددة من T-DNA المنقولة بواسطة Agrobacterium إلى الخلية ، والتي لم يتم دمجها في الجينوم المضيف ، ويبلغ ذروته بعد 2-4 أيام من الإصابة².

تجدر الإشارة إلى أن مقايسات التعبير العابر غالبا ما تكون كافية للتوصيف الوظيفي للجينات ويمكن أن تقدم العديد من المزايا على التحول المستقر. على سبيل المثال ، لا يتطلب التحول العابر إجراءات تجديد قائمة على زراعة الأنسجة. ميزة أخرى هي أنه متوافق مع التحليل الوظيفي للجينات في النبات ، وتوجد العديد من الأمثلة الناجحة للبروتوكولات الموحدة جيدا لأنواع النباتات النموذجية ، مثل Arabidopsis thaliana³ و Nicotiana benthamiana⁴ ، ولكنها لا تزال محدودة في الأنواع غير النموذجية⁵.

يعتمد تطوير المقايسات العابرة على توافر طرق فعالة لنقل الجينات. لهذا ، تعتمد الأساليب الأكثر شيوعا على تسلل Agrobacterium ، والذي يستفيد من قدرة Agrobacterium الفريدة على نقل الحمض النووي إلى الخلايا النباتية⁶. أداة أخرى مفيدة لهذه التحليلات هي استخدام جينات المراسل ، مثل البروتينات الفلورية الخضراء (GFP) ، β-glucuronidase (GUS) ، luciferase ، أو RUBY ، وكلها تستخدم لتتبع أحداث التحول. من بين أنظمة المراسلين هذه ، يعد RUBY حاليا أسهل تصور ويعتمد على تحويل التيروزين إلى betalains من خلال ثلاثة تفاعلات خطوة إنزيمية. على عكس أنظمة المراسلة الأخرى ، يمكن ملاحظة betalains الناتجة بسهولة كأصباغ ذات ألوان زاهية على الأنسجة النباتية المحولة دون الحاجة إلى معدات متطورة أو متفاعلات إضافية⁷.

عند التسلل إلى تعليق Agrobacterium في الفضاء بين الخلايا لميزوفيل الأوراق ، فإن الخطوة الأكثر أهمية للعدوى الزراعية الناجحة هي التغلب على الحاجز المادي الذي تفرضه بشرة البشرة للأوراق⁸. بينما بالنسبة لبعض النباتات ، فإن تدرج الضغط الناتج عن حقنة بدون إبرة (حقنة تسلل زراعي) يكفي لتسلل زراعي فعال ، كما يحدث في Nicotiana benthamiana⁹ ، قد تتطلب الأنواع النباتية الأخرى تدرجا أكبر للضغط مثل الذي تم إنشاؤه بمساعدة مضخات التفريغ¹⁰. في العمليات بمساعدة الفراغ ، يحدث التسلل الزراعي في خطوتين. في الأول ، يعمل الفراغ على إخضاع المادة النباتية لضغط منخفض ، مما يجبر على إطلاق الغازات من المساحات الهوائية المتوسطة من خلال الثغور والجروح. ثم ، خلال مرحلة إعادة الضغط ، يتسلل تعليق Agrobacterium إلى المساحات بين الخلايا عبر الثغور والجروح¹¹.

بالمقارنة مع تسلل المحاقن ، يسمح التسلل الفراغي بتكرار استخدام أعلى وقابلية للتكرار والقدرة على التحكم في الضغط والمدة في كل مرحلة من مراحل عملية التسلل¹⁰. في أوراق الأنواع النباتية المختلفة مثل السبانخ (Spinacia oleracea)¹² ، الفاوانيا (نبات خشبي معمر) (Paeonia ostii)¹³ ، واللوبيا (Vigna unguiculata)¹⁴ ، حققت بروتوكولات التسلل الزراعي الفراغي معدل تسلل أعمق من تسلل المحاقن. وبالمثل ، في الطماطم (Lycopersicon esculentum)¹⁵ ، والجربرة (Gerbera hybrida)¹⁶ ، أنتج التسلل الزراعي الفراغي إسكاتا جينيا أقوى وأكثر اتساقا من تسلل المحاقن. ميزة إضافية للتسلل الفراغي هي انخفاض الاعتماد على النمط الوراثي ، مقارنة بتسلل المحاقن ، والذي لوحظ مؤخرا في ثلاثة أنواع من الحمضيات (Fortunella obovata ، Citrus limon ، و C. grandis)¹⁷. ومع ذلك ، عند محاولة تطبيق التسلل الزراعي الفراغي على النباتات الكبيرة جدا بحيث لا يمكن وضعها في المجففات ، يمكن أن يكون حجم غرف التفريغ قيدا ، كما يحدث عادة مع النباتات الخشبية الاستوائية.

أدناه ، نصف بروتوكولا يتغلب على القيود المكانية لغرف التفريغ ، ويختبر فائدته في التحول العابر لأوراق الكاكاو. نقدم أول طريقة تسلل فراغ موضعية للكاكاو ، والتي لا تتطلب معدات إضافية وحتى تسمح باستخدام نفس المجففات المختبرية المستخدمة في تسلل المصنع بأكمله ، ولكن مع تكيف بسيط يسمح بالوصول إلى جزء من النبات داخل غرفة التفريغ ، مما يسمح باستخدامه في مراحل مختلفة من تطوير المصنع. لاختبار فائدة طريقة التسلل الفراغي الموضعية المقترحة ، اخترنا الكاكاو كوكيل لأنواع النباتات الاستوائية ذات الأوراق الكبيرة التي يصعب تحويلها. باستخدام طريقة التسلل الموضعية هذه ، أبلغنا مؤخرا عن أول تعبير عابر في النبات في الأفوكادو عن طريق التسلل الفراغي بوساطة Agrobacterium مع ظروف تم تحسينها مسبقا للأوراق المنفصلة¹⁸ ، وهنا نبلغ عن أول تعبير عابر في النبات في الكاكاو.

Protocol

1. ثقافة أجروباكتريوم توميفاسينس

1. ذوبان الخلايا الكهربائية من سلالة Agrobacterium tumefaciens LBA4404.
2. أضف 1 مل من شعير الخميرة (YM; الجدول 1) مرق إلى أنبوب ثقافة 17 مم × 100 مم. احفظ هذا الأنبوب لوقت لاحق ، واحتفظ به في درجة حرارة الغرفة (RT).
3. في أنبوب ميكروفوج سعة 1.5 مل ، أضف 30 ميكرولتر من خلايا Agrobacterium المذابة و 100-250 نانوغرام (حتى 5 ميكرولتر) من الحمض النووي الذي يحتوي على 35S: RUBY. تخلط بلطف.
   ملاحظة: كان 35S: RUBY هدية من يوندي تشاو. لتجنب انحناء العينة ، قلل من وجود المركبات الأيونية قدر الإمكان. قد تكون هذه المركبات الأيونية أملاح متبقية من ترسيب الإيثانول للحمض النووي¹⁹.
4. في هذه المرحلة ، ضع كوفيت التثقيب الكهربائي 1 مم على الجليد.
5. انقل مزيج التعليق السابق إلى كوفيت تبريد كهربائي 1 مم. احتفظ بكل شيء على الجليد. امسح الأقطاب المعدنية للكوفيت.
6. اضبط جهاز الحفر الكهربائي على Agr (2.2 كيلو فولت ، ~ 5 مللي ثانية ، 1 نبضة). ضع الكوفيت داخل غرفة التثقيب الكهربائي.
7. اضغط على زر النبض . تسجيل معلمات النبض. إذا كانت العينة مقوسة ، فشلت عملية التثقيب الكهربائي.
   ملاحظة: من الأهمية بمكان نقل الخلايا بسرعة إلى مرق YM مباشرة بعد النبض. يمكن أن يؤدي تأخير هذا النقل إلى تقليل كفاءة التحول بشكل كبير²⁰.
8. على الفور ، استخدم مرق YM المحفوظ لنقل الخلايا من الكوفيت إلى أنبوب 17 مم × 100 مم. أعد تعليق الخلايا برفق.
9. احتضان الخلايا المحولة لمدة 3 ساعات عند 28 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة على حاضنة مدارية.
   ملاحظة: هذه الثقافة لا تحتوي على مضادات حيوية. كن حذرا بشأن الظروف العقيمة المناسبة.
10. قم بخط هذه الثقافة على لوحات أجار YM الانتقائية²¹. بالنسبة لسلالة LBA4404-RUBY المحولة ، تأكد من أن هذه الألواح تحتوي على ريفامبيسين (25 ميكروغرام / مل) ، وسبكتينومايسين (50 ميكروغرام / مل) ، والستربتومايسين (50 ميكروغرام / مل). احتضن هذا الطبق طوال الليل في حاضنة قائمة 28 درجة مئوية.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تم استخدام المتجه 35S: RUBY ، والذي يمنح مقاومة بكتيرية للسبكتينومايسين (50 ميكروغرام / مل) ويعمل كمراسل مرئي على الأنسجة النباتية المتسللة.
11. تلقيح المستعمرات من الثقافة الليلية على 12.5 مل من خليط من مرق YM ومرق لوريا بيرتاني (LB) (بنسبة 9: 1 ، على التوالي) ، 10 mM من MES ، درجة الحموضة 5.7²². تأكد من أن هذا الوسط السائل الانتقائي يحتوي على نفس المضادات الحيوية المستخدمة في الخطوة 1.10. راجع الجدول 1 لمعرفة مكونات وتركيزات هذه الوسائط.
    1. عند احتضان Agrobacterium ، اترك مساحة تهوية كافية للثقافة ، حوالي 4 إلى 5 أضعاف حجم السائل. استخدم مرق YM لسلالة Agrobacterium LBA4404 لتجنب تكتل الخلايا²³.
12. احتضان الثقافة لمدة 16 ساعة عند 250 دورة في الدقيقة على حاضنة مدارية 28 درجة مئوية.
13. قم بتوسيع نطاق الثقافة حتى 10 أضعاف الحجم الأولي بنفس الوسيط المستخدم في الخطوة 1.11.
14. احتضان الثقافة لمدة 16 ساعة و 250 دورة في الدقيقة على حاضنة مدارية 28 درجة مئوية.
15. اضبط الثقافة الليلية على كثافة بصرية (OD₆₀₀) تبلغ 0.4. أضف 20 ميكرومتر من الأسيتوسيرينجون (AS).
16. احتضان عند 250 دورة في الدقيقة على حاضنة مدارية 28 درجة مئوية حتى يصل OD₆₀₀ إلى حوالي 1.0.
17. أجهزة الطرد المركزي الخلايا عند 4 500 × g لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية.
18. أعد تعليق الحبيبات بمحلول التعليق (10 mM MES ، 10 mM MgCl₂ ، pH 5.7) ، مع ضبط OD₆₀₀ إلى 0.6. أضف 200 ميكرومتر مثل²⁴.
    ملاحظة: احتضان محلول التعليق مسبقا عند 28 درجة مئوية. إذا كان محلول التعليق باردا عند إضافته ، فسوف تترسب الخلايا.
19. اترك المعلق البكتيري لمدة 2-24 ساعة في الظروف المظلمة و 25 درجة مئوية. التحريض غير مطلوب²².

2. اختيار النبات

1. اختر نباتا له فرع بأوراق في المرحلة المثلى للتسلل الزراعي.
   ملاحظة: قد يكون النبات كامل النمو أو شجرة ناضجة. بالنسبة للكاكاو ، يوصى باستخدام الأوراق الصغيرة من المرحلة C. هذه الأوراق برونزية إلى خضراء فاتحة اللون. لم يتم توسيعها بالكامل ولا جامدة مثل أوراق المرحلة^{D 25} (الشكل 1).
   1. كعنصر تحكم ، قم في نفس الوقت بإجراء تسلل زراعي على نباتات أخرى (على سبيل المثال ، Nicotiana tabacum) بكفاءة تسلل زراعي عالية تم الإبلاغ عنها للسلالة والناقل المستخدم.
      ملاحظة: إذا لم يتم الحصول على نتائج إيجابية في هذا التحكم ، فمن الممكن أن تكون النتائج السلبية ناتجة عن الإجهاد أو الناقل المستخدم.

3. إعداد غرفة فراغ

1. كغرفة تفريغ ، استخدم مجففا يحتوي على مقياس فراغ لقياس ضغط الفراغ بالداخل.
2. أضف 250 ميكرومتر من حمض الياسمونيك (JA)^18,26 إلى تعليق Agrobacterium من الخطوة 1.19.
3. انقل مزرعة Agrobacterium إلى دورق واسع الفم لغمر الفرع والأوراق المحددة. ثم ضع الدورق مع ثقافة Agrobacterium داخل المجفف.
4. ضع الفرع بين المجفف وغطاءه. تأكد من غمر الأوراق المرغوبة داخل ثقافة Agrobacterium . بعد ذلك ، استخدم حلقة القفز ، وهي حلقة مستديرة ذات فتحة تسمح لفرع النبات بدخول المجفف. تعمل حلقة القفز أيضا كفاصل بين الجزء السفلي والعلوي من المجفف.
5. تأكد من أن الحشية مستقرة هيكليا بدرجة كافية لتجنب سحقها بالغطاء ، ومرنة بما يكفي للانحناء والتكيف مع محيط المجفف ، وليست مصنوعة من مادة مسامية.
   ملاحظة: استخدمت هذه الدراسة سلكا معدنيا مقطعا يتكون من عدة أسلاك أصغر ملتوية معا ، ومغلفة بمادة بلاستيكية غير مسامية تشبه الحشية (الشكل 2).
6. لتثبيت الفرع على المجفف ، استخدم مادة انطباع السيليكون. تأكد من أن المادة لزجة وغير مسامية وخاملة كيميائيا للمجفف والنبات ، وسهلة التطبيق وملء الفجوات الصغيرة بين الفرع والحشية والمجفف.
7. بمجرد أن تتبلمر مادة انطباع السيليكون (يستغرق ذلك حوالي 1 دقيقة) وتثبت الفرع في مكانه ، أغلق المجفف. تأكد من عدم ترك أي ثغرات.
8. قم بتوصيل المجفف بمضخة التفريغ (الشكل 3).

4. تسلل الفراغ

1. ابدأ تشغيل مضخة التفريغ حتى تصل إلى -0.07 ميجا باسكال.
2. بمجرد وصوله إلى هذا الضغط ، أغلق صمام الضغط وأوقف تشغيل مضخة التفريغ. حافظ على هذا الضغط لمدة 5 دقائق.
3. افتح صمام الضغط لاستعادة ضغط الغرفة.
   ملاحظة: هذه خطوة حاسمة. استعادة ضغط الغرفة تدريجيا وثبات. قد يستغرق الأمر ما يصل إلى 3 دقائق لإعادة ضغط المجفف بالكامل. تزيد إعادة الضغط الممتدة من عدد البكتيريا المتسللة داخل الأنسجة¹⁰.
4. كرر هذه العملية مرتين أخريين.
5. أخرج الفرع من تعليق الخلية والمجفف.
6. تنظيف الأوراق المتسللة بالماء المقطر.

5. حضانة الأوراق المتسللة

1. دع الأوراق المتسللة تبقى في ظروف مظلمة عند 25 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
2. بعد ذلك ، قم بتعريض الأنسجة المخترقة لفترة ضوئية فاتحة / داكنة 16/8 ساعة.
3. تقييم تحول الأوراق العابرة بعد 3-7 أيام من الإصابة (DPI).

الشكل 1: أوراق الكاكاو مراحل النمو. (أ-ه) مراحل النمو²⁵. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تكوين غرفة الفراغ ومكوناتها. غرفة التفريغ عبارة عن مجفف متصل بمقياس فراغ. يتم قطع الحشية / الحلقة O بحيث يكون لها فتحة حيث سيتم وضع الفرع. (أ) مقياس الفراغ ، (ب) الغطاء ، (ج) الحشية / الحلقة O ، (د) صمام الضغط ، (ه) المجفف ، (و) الخرطوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: في نظام التسلل الزراعي فراغ بلانتا . لتجنب خسائر الفراغ أثناء عملية التسلل ، من الأهمية بمكان تأمين الفرع بالمجفف والحشية / الحلقة O بمادة انطباع السيليكون. (أ) نبات الكاكاو، (ب) غرفة التفريغ، (ج) مادة انطباع السيليكون، (د) الأوراق المغمورة على معلق Agrobacterium ، (ه) مضخة التفريغ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

النتائج

يقدم هذا البروتوكول طريقة فعالة للتسلل الزراعي للنباتات الخشبية كبيرة الحجم. باستخدام هذا البروتوكول ، تمكنا من تحقيق ضغط فراغ يبلغ -0.07 ميجا باسكال ، مما أدى إلى تسلل فعال وموضعي لأوراق الكاكاو. في الشكل 4 ، نلاحظ عملية إعداد نظام التسلل ، وفي الشكل 5 ، التكو...

Discussion

في هذا العمل ، قدمنا بروتوكول تسلل زراعي فعال ومنخفض التكلفة للتحول العابر للنباتات الخشبية في النبات ، باستخدام نباتات الكاكاو كمثال. بالنظر إلى القيد المعروف الذي تمثله بشرة الأوراق لتحويل الأنسجة النباتية ، ركزنا على تطوير استراتيجية لتسهيل التسلل الزراعي عن طريق الفراغ في النب?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35S:RUBY plasmid	Addgene	160908	http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908
1 mm electroporation cuvette	Thermo Fisher Scientific	FB101	Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus
Desiccator	Bel-Art SP SCIENCEWARWE	F42400-2121
Freeze dryer	LABCONCO	700402040
K2HPO4	Sigma Aldrich	P8281-500G	For YM medium add 0.38 g/L
LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium	Intact Genomics USA	1285-12	https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/
Mannitol	Sigma Aldrich	63560-250G-F	For YM medium add 10 g/L
MES	Sigma Aldrich	PHG0003	(For LB, YM and resuspension medium) add 1.95 g/L (10mM)
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266	For resuspension medium add 0.952 g/L (10 mM)
MgSO4·7H20	Sigma Aldrich	63138-1KG	For YM medium add 0.204 g/L
MicroPulser Electroporation Apparatus	Biorad	165-2100
NaCl	Karal	60552	For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.1 g/L
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	13-400-518
President Silicone Impression material	COLTENE	60019938
Rifampicin	Gold-Bio	R-120-1	(100 mg/mL)
Silicone Impression material gun	Andent	TBT06
Spectinomycin	Gold-Bio	S-140-SL10	(100 mg/mL)
Streptomycin	Gold-Bio	S-150-SL10	(100 mg/mL)
Tryptone enzymatic digest from casein	Sigma Aldrich	95039-1KG-F	For LB medium add 10 g/L
Yeast extract	MCD LAB	9031	For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.4 g/L