التسلل الزراعي القسري بالفراغ للتحول في النبات للنباتات المتمردة: الكاكاو كدراسة حالة

Summary

هنا ، نقدم البروتوكول الأول للتسلل الفراغي الموضعي للدراسات في الجسم الحي للتحول الوراثي للنباتات كبيرة الحجم. باستخدام هذه المنهجية ، حققنا لأول مرة التحول العابر للكاكاو بوساطة Agrobacterium في النبات.

Abstract

عابر في تحول النبات هو بديل سريع وفعال من حيث التكلفة للتحول الوراثي للنبات. تعتمد معظم بروتوكولات التحول في النبات على استخدام التحول بوساطة Agrobacterium. ومع ذلك ، فإن البروتوكولات المستخدمة حاليا موحدة للنباتات الصغيرة الحجم بسبب القيود المادية والاقتصادية لإخضاع النباتات كبيرة الحجم للمعالجة الفراغية. يقدم هذا العمل بروتوكولا فعالا للتسلل الزراعي الموضعي القائم على الفراغ المخصص للنباتات كبيرة الحجم. لتقييم فعالية الطريقة المقترحة ، اختبرنا استخدامها في نباتات الكاكاو ، وهي أنواع نباتية استوائية متمردة على التحول الجيني. سمح بروتوكولنا بتطبيق ما يصل إلى 0.07 ميجا باسكال فراغ ، مع التكرار ، على جزء جوي موضعي من أوراق الكاكاو ، مما يجعل من الممكن إجبار تسلل Agrobacterium إلى المساحات بين الخلايا للأوراق المرفقة. نتيجة لذلك ، حققنا عابر بوساطة Agrobacterium في تحويل النبات لأوراق الكاكاو المرفقة التي تعبر عن نظام مراسل RUBY. هذا هو أيضا أول Agrobacterium بوساطة في تحول النبات العابر للكاكاو. سيسمح هذا البروتوكول بتطبيق طريقة الترشيح الزراعي القائمة على الفراغ على الأنواع النباتية الأخرى ذات القيود المماثلة في الحجم ويفتح الباب أمام توصيف الجينات في النبات في الأنواع الخشبية الكبيرة الحجم المتمردة.

Introduction

تعد طرق التحول الوراثي للنبات ضرورية لاختبار الوظائف البيولوجية للجينات وهي مفيدة بشكل خاص اليوم نظرا للعدد الكبير من الجينات غير المميزة المتوقعة في عصر ما بعد الجينوم¹. يمكن استخدام هذه الطرق للحصول على خطوط محولة بالكامل أو للتعبير عن الجينات بشكل عابر. يحدث التحول المستقر عندما يصبح الحمض النووي الأجنبي الذي تناوله المضيف مدمجا بشكل كامل ولا رجعة فيه في جينوم المضيف ، ويتم نقل التعديلات الجينية إلى الأجيال اللاحقة. يحدث التعبير العابر ، المعروف باسم التحول العابر ، من النسخ المتعددة من T-DNA المنقولة بواسطة Agrobacterium إلى الخلية ، والتي لم يتم دمجها في الجينوم المضيف ، ويبلغ ذروته بعد 2-4 أيام من الإصابة²....

Protocol

1. ثقافة أجروباكتريوم توميفاسينس

1. ذوبان الخلايا الكهربائية من سلالة Agrobacterium tumefaciens LBA4404.
2. أضف 1 مل من شعير الخميرة (YM; الجدول 1) مرق إلى أنبوب ثقافة 17 مم × 100 مم. احفظ هذا الأنبوب لوقت لاحق ، واحتفظ به في درجة حرارة الغرفة (RT).
3. في أنبوب ميكروفوج سعة 1.5 مل ، أضف 30 ميكرولتر من خلايا Agrobacterium المذابة و 100-250 نانوغرام (حتى 5 ميكرولتر) من الحمض النووي الذي يحتوي على 35S: RUBY. تخلط بلطف.
   ملاحظة: كان 35S: RUBY هدية من يوندي تشاو. لتجنب انحناء العينة ، قلل من وجود المركبات الأيونية قدر الإمكان. قد تكون هذه المركبات الأيوني....

النتائج

يقدم هذا البروتوكول طريقة فعالة للتسلل الزراعي للنباتات الخشبية كبيرة الحجم. باستخدام هذا البروتوكول ، تمكنا من تحقيق ضغط فراغ يبلغ -0.07 ميجا باسكال ، مما أدى إلى تسلل فعال وموضعي لأوراق الكاكاو. في الشكل 4 ، نلاحظ عملية إعداد نظام التسلل ، وفي الشكل 5 ، التكو.......

Discussion

في هذا العمل ، قدمنا بروتوكول تسلل زراعي فعال ومنخفض التكلفة للتحول العابر للنباتات الخشبية في النبات ، باستخدام نباتات الكاكاو كمثال. بالنظر إلى القيد المعروف الذي تمثله بشرة الأوراق لتحويل الأنسجة النباتية ، ركزنا على تطوير استراتيجية لتسهيل التسلل الزراعي عن طريق الفراغ في النب?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35S:RUBY plasmid	Addgene	160908	http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908
1 mm electroporation cuvette	Thermo Fisher Scientific	FB101	Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus
Desiccator	Bel-Art SP SCIENCEWARWE	F42400-2121
Freeze dryer	LABCONCO	700402040
K2HPO4	Sigma Aldrich	P8281-500G	For YM medium add 0.38 g/L
LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium	Intact Genomics USA	1285-12	https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/
Mannitol	Sigma Aldrich	63560-250G-F	For YM medium add 10 g/L
MES	Sigma Aldrich	PHG0003	(For LB, YM and resuspension medium) add 1.95 g/L (10mM)
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266	For resuspension medium add 0.952 g/L (10 mM)
MgSO4·7H20	Sigma Aldrich	63138-1KG	For YM medium add 0.204 g/L
MicroPulser Electroporation Apparatus	Biorad	165-2100
NaCl	Karal	60552	For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.1 g/L
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	13-400-518
President Silicone Impression material	COLTENE	60019938
Rifampicin	Gold-Bio	R-120-1	(100 mg/mL)
Silicone Impression material gun	Andent	TBT06
Spectinomycin	Gold-Bio	S-140-SL10	(100 mg/mL)
Streptomycin	Gold-Bio	S-150-SL10	(100 mg/mL)
Tryptone enzymatic digest from casein	Sigma Aldrich	95039-1KG-F	For LB medium add 10 g/L
Yeast extract	MCD LAB	9031	For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.4 g/L