Vakuumforcierte Agroinfiltration zur In-planta-Transformation widerspenstiger Pflanzen: Kakao als Fallstudie

Zusammenfassung

Hier stellen wir das erste Protokoll für die lokalisierte Vakuuminfiltration für in vivo-Studien zur genetischen Transformation von Großpflanzen vor. Mit dieser Methodik haben wir zum ersten Mal die Agrobacterium-vermittelte transiente Transformation von Kakao erreicht.

Zusammenfassung

Die transiente in planta-Transformation ist eine schnelle und kostengünstige Alternative zur pflanzengenetischen Transformation. Die meisten Protokolle für die In-planta-Transformation basieren auf der Verwendung von Agrobacterium-vermittelter Transformation. Die derzeit verwendeten Protokolle sind jedoch aufgrund der physikalischen und wirtschaftlichen Einschränkungen, die mit einer Vakuumbehandlung verbunden sind, für kleine Anlagen standardisiert. Diese Arbeit stellt ein effektives Protokoll für die lokalisierte vakuumbasierte Agroinfiltration vor, das auf große Pflanzen zugeschnitten ist. Um die Wirksamkeit der vorgeschlagenen Methode zu bewerten, testeten wir ihre Anwendung in Kakaopflanzen, einer tropischen Pflanzenart, die gegen genetische Transformation resistent ist. Unser Protokoll ermöglichte es, ein Vakuum von bis zu 0,07 MPa mit Wiederholungen auf einen lokalisierten oberirdischen Teil der Kakaoblätter anzuwenden, wodurch es möglich wurde, die Infiltration von Agrobacterium in die Interzellularräume der anhaftenden Blätter zu erzwingen. Als Ergebnis erreichten wir die Agrobacterium-vermittelte transiente in planta-Transformation von anhaftenden Kakaoblättern, die für das RUBY-Reportersystem exprimiert werden. Dies ist auch die erste Agrobacterium-vermittelte transiente Umwandlung von Kakao in planta . Dieses Protokoll würde die Anwendung der vakuumbasierten Agroinfiltrationsmethode auf andere Pflanzenarten mit ähnlichen Größenbeschränkungen ermöglichen und die Tür für die In-planta-Charakterisierung von Genen in widerspenstigen holzigen, großformatigen Arten öffnen.

Einleitung

Pflanzengenetische Transformationsmethoden sind unerlässlich, um die biologischen Funktionen von Genen zu testen, und sind heute besonders nützlich angesichts der großen Anzahl uncharakterisierter Gene, die in der postgenomischen Ära^{vorhergesagt wurden 1}. Diese Methoden können verwendet werden, um vollständig transformierte Linien zu erhalten oder Gene vorübergehend zu exprimieren. Eine stabile Transformation tritt auf, wenn die fremde DNA, die der Wirt aufgenommen hat, vollständig und irreversibel in das Wirtsgenom integriert wird und die genetischen Veränderungen an nachfolgende Generationen weitergegeben werden. Die vorübergehende Expression....

Protokoll

1. Agrobacterium tumefaciens-Kultur

1. Elektrokompetente Zellen von Agrobacterium tumefaciens Stamm LBA4404 auftauen.
2. Fügen Sie 1 ml Hefemalz (YM; Tabelle 1) Brühe in ein 17 mm x 100 mm großes Kulturröhrchen. Bewahren Sie dieses Röhrchen für später auf und bewahren Sie es bei Raumtemperatur (RT) auf.
3. In ein 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen 30 μl der aufgetauten Agrobacterium-Zellen und 100-250 ng (bis zu 5 μl) der DNA mit 35S:RUBY geben. Vorsichtig mischen.
   HINWEIS: Der 35S:RUBY war ein Geschenk von Yunde Zhao. Um Probenlichtbögen zu vermeiden, reduz....

Diskussion

In dieser Arbeit haben wir ein effizientes, kostengünstiges Agroinfiltrationsprotokoll für die transiente Transformation von Gehölzen in planta am Beispiel von Kakaopflanzen vorgestellt. Angesichts der bekannten Einschränkung, die die Kutikula von Blättern für die Transformation von Pflanzengewebe darstellt, konzentrierten wir uns auf die Entwicklung einer Strategie zur Erleichterung der Agroinfiltration durch Vakuum bei Gehölzen, die diesem Verfahren normalerweise widerspenstig gegenüberstehen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
35S:RUBY plasmid	Addgene	160908	http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908
1 mm electroporation cuvette	Thermo Fisher Scientific	FB101	Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus
Desiccator	Bel-Art SP SCIENCEWARWE	F42400-2121
Freeze dryer	LABCONCO	700402040
K2HPO4	Sigma Aldrich	P8281-500G	For YM medium add 0.38 g/L
LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium	Intact Genomics USA	1285-12	https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/
Mannitol	Sigma Aldrich	63560-250G-F	For YM medium add 10 g/L
MES	Sigma Aldrich	PHG0003	(For LB, YM and resuspension medium) add 1.95 g/L (10mM)
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266	For resuspension medium add 0.952 g/L (10 mM)
MgSO4·7H20	Sigma Aldrich	63138-1KG	For YM medium add 0.204 g/L
MicroPulser Electroporation Apparatus	Biorad	165-2100
NaCl	Karal	60552	For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.1 g/L
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	13-400-518
President Silicone Impression material	COLTENE	60019938
Rifampicin	Gold-Bio	R-120-1	(100 mg/mL)
Silicone Impression material gun	Andent	TBT06
Spectinomycin	Gold-Bio	S-140-SL10	(100 mg/mL)
Streptomycin	Gold-Bio	S-150-SL10	(100 mg/mL)
Tryptone enzymatic digest from casein	Sigma Aldrich	95039-1KG-F	For LB medium add 10 g/L
Yeast extract	MCD LAB	9031	For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.4 g/L