真空强制农渗在 植物 内顽固植物转化中的应用——以可可为例

摘要

在这里，我们提出了第一个用于大型植物遗传转化的体内研究的局部真空浸润方案。使用这种方法，我们首次实现了农杆菌介导的植物可可瞬时转化。

摘要

植物转化中的瞬时是植物遗传转化的一种快速且具有成本效益的替代方案。大多数植物转化方案都依赖于使用农杆菌介导的转化。然而，由于将大型工厂进行真空处理的物理和经济限制，目前使用的方案是标准化的。这项工作提出了一种针对大型植物定制的局部真空农业渗透的有效方案。为了评估所提出的方法的功效，我们测试了其在可可植物中的应用，可可植物是一种难以遗传转化的热带植物物种。我们的方案允许对可可叶的局部地上部分施加高达0.07 MPa的真空，重复，从而可以迫使农杆菌浸润到附着叶的细胞间隙中。结果，我们实现了农杆菌介导的植物转化中对RUBY报告基因系统表达的附着可可叶的瞬时反应。这也是农杆菌介导的植物可可瞬时转化的首例。该协议将允许将基于真空的农业渗透方法应用于具有类似大小限制的其他植物物种，并为顽固的木本大尺寸物种的基因在植物中表征打开大门。

引言

植物遗传转化方法对于测试基因的生物学功能至关重要，鉴于后基因组时代预测的大量未表征基因，今天特别有用¹.这些方法可用于获得完全转化的细胞系或瞬时表达基因。当宿主吸收的外源DNA完全且不可逆地整合到宿主基因组中，并且遗传修饰传递给后代时，就会发生稳定转化。瞬时表达，称为瞬时转化，发生在 农杆菌 转移到细胞中的多个 T-DNA 拷贝，这些拷贝尚未整合到宿主基因组中，并在感染后 2-4 天达到峰值²。

值得注意的是，瞬时表达测定通常足以用于基因的功能表征，并且与稳定转化相比具有多种优势。例如，瞬时转化不需要基于组织培养的再生程序。另一个优点是它与 植物 基因的功能分析兼容，现有的几个成功的例子，为模式植物物种标准化了协议，如 拟南芥³ 和 本氏烟草⁴，但在非模式物种⁵中仍然受到限制。

瞬态检测的发展依赖于高效基因转移方法的可用性。为此，最流行的方法是基于 农杆菌 浸润，它利用 农杆菌 将 DNA 转移到植物细胞^{的独特能力 6}.这些分析的....

研究方案

1. 根癌农杆菌培养

1. 解冻 根癌农杆菌 菌株的电感受态细胞LBA4404。
2. 加入 1 mL 酵母麦芽 （YM; 表1）将肉汤放入 17 mm x 100 mm 培养管中。保存此试管以备后用，并将其保存在室温 （RT） 下。
3. 在 1.5 mL 微量离心管中，加入 30 μL 解冻的 农杆菌 细胞和 100-250 ng（最多 5 μL）含有 35S：RUBY 的 DNA。轻轻混合。
   注： 35S：RUBY 是赵云德送给赵云德的礼物。为避免样品电弧，请尽可能减少离子化合物的存在。这些离子化合物可能是^DNA19乙醇沉淀的残留盐。
4. 此时，将 1 mm 电穿孔比色皿放在冰上。
5. 将先前的悬浮混合物转移到冷却的 1 mm 电穿孔比色皿中。把所有东西都放在冰上。擦拭比色皿的金属电极。
6. 将电穿孔器设置为 Agr （2.2 kV，~5 ms，1 个脉冲）。将比色皿放入电穿孔室内。
7. 按 下脉冲 按钮。注册脉冲参数。如果样品呈电弧，则电穿孔过程失败。
   注意：在脉冲后立即将细胞快速转移到 YM 肉汤中至关....

讨论

在这项工作中，我们以可可植物为例，提出了一种高效、低成本的木本 植物瞬时 转化农业渗透方案。鉴于众所周知的叶子角质层对植物组织转化的限制，我们专注于开发一种策略，以促进木本植物的真空渗透，这些植物通常不愿意这个过程。

真空室内实现的真空压力只能通过有效密封和填充干燥器、树枝、垫圈/O 形圈和干燥器盖子之间产生的小间隙来实现，这是协议.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
35S:RUBY plasmid	Addgene	160908	http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908
1 mm electroporation cuvette	Thermo Fisher Scientific	FB101	Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus
Desiccator	Bel-Art SP SCIENCEWARWE	F42400-2121
Freeze dryer	LABCONCO	700402040
K2HPO4	Sigma Aldrich	P8281-500G	For YM medium add 0.38 g/L
LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium	Intact Genomics USA	1285-12	https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/
Mannitol	Sigma Aldrich	63560-250G-F	For YM medium add 10 g/L
MES	Sigma Aldrich	PHG0003	(For LB, YM and resuspension medium) add 1.95 g/L (10mM)
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266	For resuspension medium add 0.952 g/L (10 mM)
MgSO4·7H20	Sigma Aldrich	63138-1KG	For YM medium add 0.204 g/L
MicroPulser Electroporation Apparatus	Biorad	165-2100
NaCl	Karal	60552	For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.1 g/L
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	13-400-518
President Silicone Impression material	COLTENE	60019938
Rifampicin	Gold-Bio	R-120-1	(100 mg/mL)
Silicone Impression material gun	Andent	TBT06
Spectinomycin	Gold-Bio	S-140-SL10	(100 mg/mL)
Streptomycin	Gold-Bio	S-150-SL10	(100 mg/mL)
Tryptone enzymatic digest from casein	Sigma Aldrich	95039-1KG-F	For LB medium add 10 g/L
Yeast extract	MCD LAB	9031	For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.4 g/L