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在这里,我们提出了第一个用于大型植物遗传转化的体内研究的局部真空浸润方案。使用这种方法,我们首次实现了农杆菌介导的植物可可瞬时转化。
植物转化中的瞬时是植物遗传转化的一种快速且具有成本效益的替代方案。大多数植物转化方案都依赖于使用农杆菌介导的转化。然而,由于将大型工厂进行真空处理的物理和经济限制,目前使用的方案是标准化的。这项工作提出了一种针对大型植物定制的局部真空农业渗透的有效方案。为了评估所提出的方法的功效,我们测试了其在可可植物中的应用,可可植物是一种难以遗传转化的热带植物物种。我们的方案允许对可可叶的局部地上部分施加高达0.07 MPa的真空,重复,从而可以迫使农杆菌浸润到附着叶的细胞间隙中。结果,我们实现了农杆菌介导的植物转化中对RUBY报告基因系统表达的附着可可叶的瞬时反应。这也是农杆菌介导的植物可可瞬时转化的首例。该协议将允许将基于真空的农业渗透方法应用于具有类似大小限制的其他植物物种,并为顽固的木本大尺寸物种的基因在植物中表征打开大门。
植物遗传转化方法对于测试基因的生物学功能至关重要,鉴于后基因组时代预测的大量未表征基因,今天特别有用1.这些方法可用于获得完全转化的细胞系或瞬时表达基因。当宿主吸收的外源DNA完全且不可逆地整合到宿主基因组中,并且遗传修饰传递给后代时,就会发生稳定转化。瞬时表达,称为瞬时转化,发生在 农杆菌 转移到细胞中的多个 T-DNA 拷贝,这些拷贝尚未整合到宿主基因组中,并在感染后 2-4 天达到峰值2。
值得注意的是,瞬时表达测定通常足以用于基因的功能表征,并且与稳定转化相比具有多种优势。例如,瞬时转化不需要基于组织培养的再生程序。另一个优点是它与 植物 基因的功能分析兼容,现有的几个成功的例子,为模式植物物种标准化了协议,如 拟南芥3 和 本氏烟草4,但在非模式物种5中仍然受到限制。
瞬态检测的发展依赖于高效基因转移方法的可用性。为此,最流行的方法是基于 农杆菌 浸润,它利用 农杆菌 将 DNA 转移到植物细胞的独特能力 6.这些分析的另一个有用工具是使用报告基因,例如绿色荧光蛋白 (GFP)、β-葡萄糖醛酸酶 (GUS)、荧光素酶或 RUBY,所有这些都用于跟踪转化事件。在这些报告系统中,RUBY是目前最容易可视化的,它依赖于酪氨酸通过三个酶促步骤反应转化为甜菜碱。与其他报告系统相反,所得甜菜碱可以很容易地在转化的植物组织上观察到颜色鲜艳的色素,而无需复杂的设备或额外的反应物7。
当将 农杆菌 悬浮液浸润到叶肉叶肉的细胞间隙时,成功进行农业感染的最关键步骤是克服叶子表皮角质层施加的物理屏障8。虽然对于某些植物,用无针注射器(注射器Agroinfiltration)产生的压力梯度足以实现有效的农业渗透,如 Nicotiana benthamiana9中发生的情况,但其他植物物种可能需要更大的压力梯度,例如在真空泵10的帮助下产生的压力梯度。在真空辅助工艺中,农业渗透分两步进行。在第一种情况下,真空的作用是使植物材料承受减压,迫使气体通过气孔和伤口从叶肉空气空间释放。然后,在再加压阶段, 农杆菌 悬浮液通过气孔浸润细胞间隙并伤口11。
与注射器渗透相比,真空渗透允许更高的使用频率、可重复性,并且能够在渗透过程的每个阶段控制压力和持续时间10。在菠菜(Spinacia oleracea)12、牡丹(多年生木本植物)(Paeonia ostii)13和豇豆(Vigna unguiculata)14等不同植物物种的叶子中,真空农渗方案实现了比注射器浸润更深的浸润率。同样,在番茄(Lycopersicon esculentum)15和非洲菊(非洲菊杂交)16中,真空农业浸润比注射器浸润产生更强、更均匀的基因沉默。与注射器浸润相比,真空浸润的另一个优点是对基因型的依赖性较低,最近在三种柑橘品种(Fortunella obovata、 Citrus limon 和 C. grandis)中观察到了这一点17。然而,当试图将真空农业渗透应用于太大而无法放入干燥器的植物时,真空室的尺寸可能是一个限制,这通常发生在热带木本植物中。
下面,我们描述了一种克服真空室空间限制的方案,测试其在植物中可可叶瞬态转化的效用。我们提出了第一种可可的局部真空渗透方法,该方法不需要额外的设备,甚至允许使用与整个植物渗透相同的实验室干燥器,但具有简单的适应性,允许进入真空室内的植物的一部分,允许其在植物发育的不同阶段使用。为了验证所提出的局部真空渗透方法的实用性,我们选择可可作为难以转化的大叶热带植物物种的代理。使用这种局部浸润方法,我们最近报告了通过农杆菌介导的真空浸润在鳄梨中首次出现植物瞬时表达,条件先前针对分离的叶子进行了优化 18,在这里我们报告了可可中植物瞬时表达的第一次。
1. 根癌农杆菌培养
2.植物选择
3. 真空室设置
4.真空渗透
5.浸润叶的孵化
图1:可可叶发育阶段。 (A-E) 发展阶段25.请点击这里查看此图的较大版本.
图 2:真空室配置及其组件。 真空室是连接到真空计的干燥器。垫圈/O 形圈被切割,因此它有一个放置分支的开口。(A)真空计,(B)盖子,(C)垫圈/O形圈,(D)压力阀,(E)干燥器,(F)软管。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3: 在植物 真空农业渗透系统中。 为避免渗透过程中的真空损失,必须将分支固定在干燥器上,并用硅胶压印材料固定垫圈/O 形圈。(A)可可植物,(B)真空室,(C)硅胶压印材料,(D)浸没在 农杆菌 悬浮液上的叶子,(E)真空泵。 请点击这里查看此图的较大版本.
该协议为大型木本植物提供了一种有效的农业渗透方法。通过该协议,我们能够实现-0.07 MPa的真空压力,从而对可可叶进行有效的局部渗透。在 图 4 中,我们观察了渗透系统的设置过程,在 图 5 中,我们观察了最终配置。
在这项工作中,我们以可可植物为例,提出了一种高效、低成本的木本 植物瞬时 转化农业渗透方案。鉴于众所周知的叶子角质层对植物组织转化的限制,我们专注于开发一种策略,以促进木本植物的真空渗透,这些植物通常不愿意这个过程。
真空室内实现的真空压力只能通过有效密封和填充干燥器、树枝、垫圈/O 形圈和干燥器盖子之间产生的小间隙来实现,这是协议...
作者没有利益冲突需要声明。
我们感谢 Lic。赫苏斯·富恩特斯·冈萨雷斯和内斯托尔·伊万·罗伯斯·奥利瓦雷斯协助拍摄视频片段。我们感谢 CIATEJ(可可植物) 的 Antonia Gutierrez Mora 博士的慷慨捐赠。我们还要感谢 CIATEJ 和墨西哥 Laboratorio Nacional PlanTECC 的设施支持。H.E.H.D.(CVU:1135375)在墨西哥国家人类与技术委员会(CONAHCYT)的资助下进行了硕士研究。R.U.L. 感谢哈利斯科州科学与技术委员会 (COECYTJAL) 和墨西哥哈利斯科州创新与技术秘书处 (SICYT) 的支持 (Grant 7270-2018)。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
35S:RUBY plasmid | Addgene | 160908 | http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908 |
1 mm electroporation cuvette | Thermo Fisher Scientific | FB101 | Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus |
Desiccator | Bel-Art SP SCIENCEWARWE | F42400-2121 | |
Freeze dryer | LABCONCO | 700402040 | |
K2HPO4 | Sigma Aldrich | P8281-500G | For YM medium add 0.38 g/L |
LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium | Intact Genomics USA | 1285-12 | https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/ |
Mannitol | Sigma Aldrich | 63560-250G-F | For YM medium add 10 g/L |
MES | Sigma Aldrich | PHG0003 | (For LB, YM and resuspension medium) add 1.95 g/L (10mM) |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | For resuspension medium add 0.952 g/L (10 mM) |
MgSO4·7H20 | Sigma Aldrich | 63138-1KG | For YM medium add 0.204 g/L |
MicroPulser Electroporation Apparatus | Biorad | 165-2100 | |
NaCl | Karal | 60552 | For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.1 g/L |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
President Silicone Impression material | COLTENE | 60019938 | |
Rifampicin | Gold-Bio | R-120-1 | (100 mg/mL) |
Silicone Impression material gun | Andent | TBT06 | |
Spectinomycin | Gold-Bio | S-140-SL10 | (100 mg/mL) |
Streptomycin | Gold-Bio | S-150-SL10 | (100 mg/mL) |
Tryptone enzymatic digest from casein | Sigma Aldrich | 95039-1KG-F | For LB medium add 10 g/L |
Yeast extract | MCD LAB | 9031 | For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.4 g/L |
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