難治性植物の プランタ内 変態のための真空強制農業浸透:ケーススタディとしてのカカオ

要約

ここでは、大型植物の遺伝的形質転換の in vivo 研究のための局所真空浸透のための最初のプロトコルを紹介します。この方法論を用いて、 アグロバクテリウムを介したカカオ のプランタ 一過性形質転換を世界で初めて達成しました。

要約

一過性の プランタ 形質転換は、植物の遺伝的形質転換のための迅速で費用対効果の高い代替手段です。 Plantaの 変形のためのほとんどのプロトコルはア グロバクテリウム仲介された変形の使用に頼る。しかし、現在使用されているプロトコルは、大型プラントを真空処理にかけることの物理的および経済的制約により、小規模プラント向けに標準化されています。この研究は、大型植物用にカスタマイズされた局所的な真空ベースの農業浸透のための効果的なプロトコルを提示します。提案手法の有効性を評価するため、遺伝子組み換えに抵抗性のある熱帯植物種であるカカオ植物での使用を検証しました。私たちのプロトコールでは、カカオ葉の局所的な地上部に最大0.07MPaの真空を繰り返し適用することができ、付着した葉の細胞間空間に アグロバクテリウム を強制的に浸透させることが可能になりました。その結果、ア グロバクテリウムを介した付着カカオ葉の プランタ 形質転換における一過性現象をRUBYレポーターシステムで発現させることに成功しました。また、これはア グロバクテリウムが媒介する初めての プランタ 一過性カカオの形質転換です。このプロトコルは同じようなサイズの抑制の他の植物種に真空基づかせていたagroinfiltration方法の適用を可能にし、recalcitrant木質、大型種の遺伝子の planta の性格描写のためのドアを開ける。

概要

植物の遺伝子組み換え法は、遺伝子の生物学的機能を調べるために不可欠であり、ポスト^{ゲノム時代に予測}される多数の未解明遺伝子を考えると、今日では特に有用である1。これらの方法は、完全に形質転換された系統を取得したり、遺伝子を一過性に発現させたりするために使用できます。宿主が取り込んだ外来DNAが宿主ゲノムに完全かつ不可逆的に組み込まれ、遺伝子組み換えが次の世代に受け継がれることで、安定した形質転換が起こります。一過性形質転換として知られる一過性発現は、 アグロバクテリウム によって細胞内に移植されたT-DNAの複数のコピーから発生し^、宿主ゲノムに組み込まれておらず、感染後2〜4日でピークに達します2。

一過性発現アッセイは、遺伝子の機能的特性評価に十分であり、安定した形質転換よりもいくつかの利点があることは注目に値します。例えば、一過性形質転換では、組織培養ベースの再生手順は必要ありません。もう一つの利点は、シロイヌナズナ3やニコチアナ・ベンサミアナ4などのモデル植物種で十分に標準化されたプロトコルのいくつかの成功例である^が、非モデル種⁵ではまだ限られている遺伝子のplanta

プロトコル

1. アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)の培養

1. Agrobacterium tumefaciens株LBA4404のエレクトロコンピテントセルを解凍します。
2. 酵母麦芽(YM; 表1)17 mm x 100 mmの培養チューブにブロスを入れます。このチューブは後で使用するために保存し、室温(RT)で保管してください。
3. 1.5 mLのマイクロチューブに、30 μLの解凍した アグロバクテリウム 細胞と100-250 ng(最大5 μL)の 35S:RUBYを含むDNAを加えます。穏やかに混ぜます。
   注: 35S:RUBY はYunde Zhaoからの贈り物です。サンプルのアーク放電を防ぐには、イオン性化合物の存在をできるだけ減らしてください。これらのイオン性化合物は、^DNA19のエタノール沈殿からの残存塩であってもよい。
4. この時点で、1mmのエレクトロポレーションキュベットを氷の上に置きます。
5. 前の懸濁液を冷やした1 mmのエレクトロポレーションキュベットに移します。すべてを氷の上に置いてください。キュベットの金属電極を拭きます。
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ディスカッション

本研究では、カカオ植物を例に、木本植物の プランタ一 過性形質転換のための効率的で低コストな農業浸透プロトコルを提示した。葉のクチクラが植物組織の形質転換に及ぼす制約はよく知られているため、通常はこの手順に抵抗する木本植物の真空による農業浸透を促進する戦略の開発に集中しました。

真空チャンバー内の真空圧は、デシケーター、木の枝、.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
35S:RUBY plasmid	Addgene	160908	http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908
1 mm electroporation cuvette	Thermo Fisher Scientific	FB101	Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus
Desiccator	Bel-Art SP SCIENCEWARWE	F42400-2121
Freeze dryer	LABCONCO	700402040
K2HPO4	Sigma Aldrich	P8281-500G	For YM medium add 0.38 g/L
LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium	Intact Genomics USA	1285-12	https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/
Mannitol	Sigma Aldrich	63560-250G-F	For YM medium add 10 g/L
MES	Sigma Aldrich	PHG0003	(For LB, YM and resuspension medium) add 1.95 g/L (10mM)
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266	For resuspension medium add 0.952 g/L (10 mM)
MgSO4·7H20	Sigma Aldrich	63138-1KG	For YM medium add 0.204 g/L
MicroPulser Electroporation Apparatus	Biorad	165-2100
NaCl	Karal	60552	For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.1 g/L
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	13-400-518
President Silicone Impression material	COLTENE	60019938
Rifampicin	Gold-Bio	R-120-1	(100 mg/mL)
Silicone Impression material gun	Andent	TBT06
Spectinomycin	Gold-Bio	S-140-SL10	(100 mg/mL)
Streptomycin	Gold-Bio	S-150-SL10	(100 mg/mL)
Tryptone enzymatic digest from casein	Sigma Aldrich	95039-1KG-F	For LB medium add 10 g/L
Yeast extract	MCD LAB	9031	For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.4 g/L