Agro-infiltration forcée sous vide pour la transformation in planta de plantes récalcitrantes : le cacao comme étude de cas

Résumé

Nous présentons ici le premier protocole d’infiltration sous vide localisée pour des études in vivo de la transformation génétique de plantes de grande taille. En utilisant cette méthodologie, nous avons réalisé pour la première fois la transformation transitoire du cacao par Agrobacterium in planta .

Résumé

La transformation transitoire in planta est une alternative rapide et rentable pour la transformation génétique végétale. La plupart des protocoles de transformation in planta reposent sur l’utilisation de la transformation médiée par Agrobacterium. Cependant, les protocoles actuellement utilisés sont standardisés pour les usines de petite taille en raison des contraintes physiques et économiques liées à la soumission des usines de grande taille à un traitement sous vide. Ce travail présente un protocole efficace pour l’agroinfiltration localisée sous vide adaptée aux plantes de grande taille. Pour évaluer l’efficacité de la méthode proposée, nous avons testé son utilisation chez les cacaoyers, une espèce végétale tropicale récalcitrante à la transformation génétique. Notre protocole a permis d’appliquer jusqu’à 0,07 MPa sous vide, avec répétitions, sur une partie aérienne localisée des feuilles de cacaoyer, permettant de forcer l’infiltration d’Agrobacterium dans les espaces intercellulaires des feuilles attachées. En conséquence, nous avons réalisé la transformation transitoire médiée par Agrobacterium in planta des feuilles de cacao attachées exprimant pour le système rapporteur Ruby. Il s’agit également de la première transformation transitoire du cacao par Agrobacterium in planta . Ce protocole permettrait l’application de la méthode d’agroinfiltration sous vide à d’autres espèces végétales ayant des contraintes de taille similaires et ouvrirait la porte à la caractérisation in planta des gènes chez des espèces ligneuses récalcitrantes de grande taille.

Introduction

Les méthodes de transformation génétique végétale sont essentielles pour tester les fonctions biologiques des gènes et sont particulièrement utiles aujourd’hui compte tenu du grand nombre de gènes non caractérisés prédits dans l’ère post-génomique¹. Ces méthodes peuvent être utilisées pour obtenir des lignées entièrement transformées ou pour exprimer des gènes de manière transitoire. La transformation stable se produit lorsque l’ADN étranger que l’hôte a absorbé s’intègre complètement et irréversiblement dans le génome de l’hôte, et que les modifications génétiques sont transmises aux générations suivantes. L’expression transitoire, connue sous....

Protocole

1. Culture d’Agrobacterium tumefaciens

1. Décongeler les cellules électrocompétentes de la souche LBA4404 d’Agrobacterium tumefaciens .
2. Ajouter 1 mL de malt de levure (YM ; Tableau 1) dans un tube de culture de 17 mm x 100 mm. Conservez ce tube pour plus tard et conservez-le à température ambiante (RT).
3. Dans un tube de microfuge de 1,5 mL, ajouter 30 μL de cellules Agrobacterium décongelées et 100-250 ng (jusqu’à 5 μL) d’ADN contenant 35S :RUBY. Mélangez doucement.
   NOTE : Le 35S :RUBY était un cadeau de Yunde Zhao. Pour éviter la formation d’a....

Discussion

Dans ce travail, nous avons présenté un protocole d’agroinfiltration efficace et peu coûteux pour la transformation transitoire in planta des plantes ligneuses, en utilisant les plants de cacao comme exemple. Compte tenu de la contrainte bien connue que représente la cuticule des feuilles pour la transformation des tissus végétaux, nous nous sommes concentrés sur le développement d’une stratégie pour faciliter l’agroinfiltration par vide chez les plantes ligneuses, habituellement récalcitrantes ?.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
35S:RUBY plasmid	Addgene	160908	http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908
1 mm electroporation cuvette	Thermo Fisher Scientific	FB101	Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus
Desiccator	Bel-Art SP SCIENCEWARWE	F42400-2121
Freeze dryer	LABCONCO	700402040
K2HPO4	Sigma Aldrich	P8281-500G	For YM medium add 0.38 g/L
LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium	Intact Genomics USA	1285-12	https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/
Mannitol	Sigma Aldrich	63560-250G-F	For YM medium add 10 g/L
MES	Sigma Aldrich	PHG0003	(For LB, YM and resuspension medium) add 1.95 g/L (10mM)
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266	For resuspension medium add 0.952 g/L (10 mM)
MgSO4·7H20	Sigma Aldrich	63138-1KG	For YM medium add 0.204 g/L
MicroPulser Electroporation Apparatus	Biorad	165-2100
NaCl	Karal	60552	For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.1 g/L
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	13-400-518
President Silicone Impression material	COLTENE	60019938
Rifampicin	Gold-Bio	R-120-1	(100 mg/mL)
Silicone Impression material gun	Andent	TBT06
Spectinomycin	Gold-Bio	S-140-SL10	(100 mg/mL)
Streptomycin	Gold-Bio	S-150-SL10	(100 mg/mL)
Tryptone enzymatic digest from casein	Sigma Aldrich	95039-1KG-F	For LB medium add 10 g/L
Yeast extract	MCD LAB	9031	For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.4 g/L