İnatçı Bitkilerin Planta Dönüşümü için Vakumla Zorla Agroinfiltrasyon: Bir Vaka Çalışması Olarak Kakao

Özet

Burada, büyük boyutlu bitkilerin genetik dönüşümünün in vivo çalışmaları için lokalize vakum infiltrasyonu için ilk protokolü sunuyoruz. Bu metodolojiyi kullanarak, ilk kez kakaonun planta geçici dönüşümünde Agrobacterium aracılı hale getirdik.

Özet

Planta transformasyonunda geçici, bitki genetik transformasyonu için hızlı ve uygun maliyetli bir alternatiftir. Planta dönüşümü için çoğu protokol, Agrobacterium aracılı dönüşümün kullanımına dayanır. Bununla birlikte, şu anda kullanımda olan protokoller, büyük boyutlu bitkilerin vakum işlemine tabi tutulmasının fiziksel ve ekonomik kısıtlamaları nedeniyle küçük boyutlu tesisler için standartlaştırılmıştır. Bu çalışma, büyük boyutlu bitkiler için özelleştirilmiş lokalize vakum tabanlı agroinfiltrasyon için etkili bir protokol sunmaktadır. Önerilen yöntemin etkinliğini değerlendirmek için, genetik dönüşüme karşı inatçı tropikal bir bitki türü olan kakao bitkilerinde kullanımını test ettik. Protokolümüz, kakao yapraklarının lokalize bir hava kısmına tekrarlarla 0.07 MPa'ya kadar vakum uygulanmasına izin vererek, Agrobacterium'un bağlı yaprakların hücreler arası boşluklarına sızmasını mümkün kıldı. Sonuç olarak, RUBY raportör sistemi için eksprese edilen ekli kakao yapraklarının planta dönüşümünde Agrobacterium aracılı geçici elde ettik. Bu aynı zamanda kakaonun planta geçici dönüşümünde aracılık edilen ilk Agrobacterium'dur. Bu protokol, vakum bazlı agroinfiltrasyon yönteminin benzer boyut kısıtlamalarına sahip diğer bitki türlerine uygulanmasına izin verecek ve inatçı odunsu, büyük boyutlu türlerde genlerin bitki karakterizasyonu için kapıyı açacaktır.

Giriş

Bitki genetik dönüşüm yöntemleri, genlerin biyolojik işlevlerini test etmek için gereklidir ve genom sonrası dönemde tahmin edilen çok sayıda karakterize edilmemiş gen göz önüne alındığında günümüzde özellikle yararlıdır¹. Bu yöntemler, tamamen dönüştürülmüş çizgiler elde etmek veya genleri geçici olarak ifade etmek için kullanılabilir. Kararlı dönüşüm, konakçının aldığı yabancı DNA, konakçı genomuna tamamen ve geri döndürülemez bir şekilde entegre olduğunda ve genetik modifikasyonlar sonraki nesillere aktarıldığında meydana gelir. Geçici transformasyon olarak bilinen geçici ekspresyon, Agrobacterium tarafından hücreye aktarılan, konak....

Protokol

1. Agrobacterium tumefaciens kültürü

1. Agrobacterium tumefaciens suşu LBA4404'nin elektroyetkin hücrelerini çözün.
2. 1 mL maya malt ekleyin (YM; Tablo 1) 17 mm x 100 mm'lik bir kültür tüpüne et suyu. Bu tüpü daha sonrası için saklayın ve oda sıcaklığında (RT) saklayın.
3. 1.5 mL'lik bir mikrofüj tüpüne, 30 μL çözülmüş Agrobacterium hücresi ve 35S:RUBY içeren 100-250 ng (5 μL'ye kadar) DNA ekleyin. Yavaşça karıştırın.
   NOT: 35S:RUBY , Yunde Zhao'nun hediyesiydi. Numune arkını önlemek için, iyonik bileşiklerin varlığını mümkün olduğunca azaltın. Bu iy....

Tartışmalar

Bu çalışmada, örnek olarak kakao bitkilerini kullanarak, odunsu bitkilerin planta geçici dönüşümü için verimli, düşük maliyetli bir agroinfiltrasyon protokolü sunduk. Yaprakların kütikülünün bitki dokularının dönüşümü için temsil ettiği iyi bilinen kısıtlama göz önüne alındığında, genellikle bu prosedüre karşı inatçı olan odunsu bitkilerde vakumla agroinfiltrasyonu kolaylaştırmak için bir strateji geliştirmeye odaklandık.

Vakum odası i?.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
35S:RUBY plasmid	Addgene	160908	http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908
1 mm electroporation cuvette	Thermo Fisher Scientific	FB101	Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus
Desiccator	Bel-Art SP SCIENCEWARWE	F42400-2121
Freeze dryer	LABCONCO	700402040
K2HPO4	Sigma Aldrich	P8281-500G	For YM medium add 0.38 g/L
LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium	Intact Genomics USA	1285-12	https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/
Mannitol	Sigma Aldrich	63560-250G-F	For YM medium add 10 g/L
MES	Sigma Aldrich	PHG0003	(For LB, YM and resuspension medium) add 1.95 g/L (10mM)
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266	For resuspension medium add 0.952 g/L (10 mM)
MgSO4·7H20	Sigma Aldrich	63138-1KG	For YM medium add 0.204 g/L
MicroPulser Electroporation Apparatus	Biorad	165-2100
NaCl	Karal	60552	For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.1 g/L
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	13-400-518
President Silicone Impression material	COLTENE	60019938
Rifampicin	Gold-Bio	R-120-1	(100 mg/mL)
Silicone Impression material gun	Andent	TBT06
Spectinomycin	Gold-Bio	S-140-SL10	(100 mg/mL)
Streptomycin	Gold-Bio	S-150-SL10	(100 mg/mL)
Tryptone enzymatic digest from casein	Sigma Aldrich	95039-1KG-F	For LB medium add 10 g/L
Yeast extract	MCD LAB	9031	For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.4 g/L