İnatçı Bitkilerin Planta Dönüşümü için Vakumla Zorla Agroinfiltrasyon: Bir Vaka Çalışması Olarak Kakao

Özet

Burada, büyük boyutlu bitkilerin genetik dönüşümünün in vivo çalışmaları için lokalize vakum infiltrasyonu için ilk protokolü sunuyoruz. Bu metodolojiyi kullanarak, ilk kez kakaonun planta geçici dönüşümünde Agrobacterium aracılı hale getirdik.

Özet

Planta transformasyonunda geçici, bitki genetik transformasyonu için hızlı ve uygun maliyetli bir alternatiftir. Planta dönüşümü için çoğu protokol, Agrobacterium aracılı dönüşümün kullanımına dayanır. Bununla birlikte, şu anda kullanımda olan protokoller, büyük boyutlu bitkilerin vakum işlemine tabi tutulmasının fiziksel ve ekonomik kısıtlamaları nedeniyle küçük boyutlu tesisler için standartlaştırılmıştır. Bu çalışma, büyük boyutlu bitkiler için özelleştirilmiş lokalize vakum tabanlı agroinfiltrasyon için etkili bir protokol sunmaktadır. Önerilen yöntemin etkinliğini değerlendirmek için, genetik dönüşüme karşı inatçı tropikal bir bitki türü olan kakao bitkilerinde kullanımını test ettik. Protokolümüz, kakao yapraklarının lokalize bir hava kısmına tekrarlarla 0.07 MPa'ya kadar vakum uygulanmasına izin vererek, Agrobacterium'un bağlı yaprakların hücreler arası boşluklarına sızmasını mümkün kıldı. Sonuç olarak, RUBY raportör sistemi için eksprese edilen ekli kakao yapraklarının planta dönüşümünde Agrobacterium aracılı geçici elde ettik. Bu aynı zamanda kakaonun planta geçici dönüşümünde aracılık edilen ilk Agrobacterium'dur. Bu protokol, vakum bazlı agroinfiltrasyon yönteminin benzer boyut kısıtlamalarına sahip diğer bitki türlerine uygulanmasına izin verecek ve inatçı odunsu, büyük boyutlu türlerde genlerin bitki karakterizasyonu için kapıyı açacaktır.

Giriş

Bitki genetik dönüşüm yöntemleri, genlerin biyolojik işlevlerini test etmek için gereklidir ve genom sonrası dönemde tahmin edilen çok sayıda karakterize edilmemiş gen göz önüne alındığında günümüzde özellikle yararlıdır¹. Bu yöntemler, tamamen dönüştürülmüş çizgiler elde etmek veya genleri geçici olarak ifade etmek için kullanılabilir. Kararlı dönüşüm, konakçının aldığı yabancı DNA, konakçı genomuna tamamen ve geri döndürülemez bir şekilde entegre olduğunda ve genetik modifikasyonlar sonraki nesillere aktarıldığında meydana gelir. Geçici transformasyon olarak bilinen geçici ekspresyon, Agrobacterium tarafından hücreye aktarılan, konakçı genomuna entegre edilmemiş T-DNA'nın çoklu kopyalarından oluşur ve enfeksiyondan 2-4 gün sonra zirve yapar².

Geçici ekspresyon tahlillerinin genellikle genlerin fonksiyonel karakterizasyonu için yeterli olduğunu ve kararlı dönüşüme göre çeşitli avantajlar sunabileceğini belirtmekte fayda var. Örneğin, geçici dönüşüm, doku kültürüne dayalı rejenerasyon prosedürleri gerektirmez. Diğer bir avantaj, Arabidopsis thaliana³ ve Nicotiana benthamiana⁴ gibi model bitki türleri için iyi standartlaştırılmış birkaç başarılı protokol örneği olan genlerin planta fonksiyonel analizi ile uyumlu olmasıdır, ancak model olmayan türlerde^{hala sınırlıdır 5}.

Geçici tahlillerin geliştirilmesi, verimli gen transfer yöntemlerinin mevcudiyetine dayanır. Bunun için en popüler yaklaşımlar, Agrobacterium'un DNA'yı bitki hücrelerine aktarma konusundaki benzersiz yeteneğinden yararlanan Agrobacterium infiltrasyonuna dayanmaktadır⁶. Bu analizler için bir başka yararlı araç, tümü dönüşüm olaylarını izlemek için kullanılan yeşil floresan proteinleri (GFP), β-glukuronidaz (GUS), lusiferaz veya RBY gibi raportör genlerin kullanılmasıdır. Bu raportör sistemler arasında, RUBY şu anda görselleştirilmesi en kolay olanıdır ve üç enzimatik adım reaksiyonu yoluyla tirozinin betalainlere dönüştürülmesine dayanır. Diğer raporlayıcı sistemlerin aksine, ortaya çıkan betalainler, karmaşık ekipmana veya ek reaktanlara ihtiyaç duymadan dönüştürülmüş bitki dokusu üzerinde parlak renkli pigmentler olarak kolayca gözlemlenebilir⁷.

Bir Agrobacterium süspansiyonunu yaprak mezofilinin hücreler arası boşluğuna sızarken, başarılı agroenfeksiyon için en kritik adım, yaprakların^epidermal kütikülünün dayattığı fiziksel engelin üstesinden gelmektir 8. Bazı bitkiler için, iğnesiz bir şırınga (şırınga Agroinfiltrasyonu) ile oluşturulan bir basınç gradyanı, verimli bir agroinfiltrasyon için yeterli olsa da, Nicotiana benthamiana^9'da olduğu gibi, diğer bitki türleri, vakum pompaları yardımıyla oluşturulan gibi daha büyük bir basınç gradyanı gerektirebilir¹⁰. Vakum destekli işlemlerde, agroinfiltrasyon iki adımda gerçekleşir. İlkinde vakum, bitki materyalini düşük basınca maruz bırakmaya hizmet eder ve gazların mezofil hava boşluklarından stomalar ve yaralar yoluyla salınmasını zorlar. Daha sonra, bir yeniden basınçlandırma aşaması sırasında, Agrobacterium süspansiyonu stomalar yoluyla hücreler arası boşluklara sızar ve^{yaralar 11}.

Şırınga sızması ile karşılaştırıldığında, vakum sızması, daha yüksek kullanım sıklığı, tekrarlanabilirlik ve sızma işleminin her aşamasında basıncı ve süreyi kontrol etme yeteneği sağlar¹⁰. Ispanak (Spinacia oleracea)¹², şakayık (çok yıllık odunsu bir bitki) (Paeonia ostii)¹³ ve Börülce (Vigna unguiculata)¹⁴ gibi farklı bitki türlerinin yapraklarında, vakumlu agroinfiltrasyon protokolleri, şırınga infiltrasyonundan daha derin bir infiltrasyon oranı elde etti. Benzer şekilde, domateste (Lycopersicon esculentum)¹⁵ ve gerbera'da (Gerbera hybrida)¹⁶, vakumlu agroinfiltrasyon, şırınga infiltrasyonundan daha güçlü ve daha homojen gen susturma üretti. Vakum infiltrasyonunun ek bir avantajı, son zamanlarda üç narenciye çeşidinde (Fortunella obovata, Citrus limon ve C. grandis) gözlenen şırınga infiltrasyonuna kıyasla genotipe daha düşük bağımlılıktır17. Bununla birlikte, desikatörlere sığamayacak kadar büyük bitkilere vakumlu agroinfiltrasyon uygulamaya çalışırken, tipik olarak tropikal odunsu bitkilerde olduğu gibi, vakum odalarının boyutu bir sınırlama olabilir.

Aşağıda, vakum odalarının uzamsal sınırlamasının üstesinden gelen ve kakao yapraklarının planta geçici dönüşümü için faydasını test eden bir protokolü açıklıyoruz. Kakao için ek ekipman gerektirmeyen ve hatta tüm bitkinin sızması için kullanılan aynı laboratuvar kurutucularının kullanımına izin veren, ancak bitkinin bir kısmının vakum odası içinde erişmesine izin veren basit bir uyarlama ile ilk lokalize vakum infiltrasyon yöntemini sunuyoruz. Önerilen lokalize vakum sızma yönteminin kullanışlılığını test etmek için, kakaoyu dönüştürülmesi zor olan büyük yapraklı tropikal bir bitki türünün vekili olarak seçtik. Bu lokalize infiltrasyon yöntemini kullanarak, yakın zamanda avokadoda Agrobacterium aracılı vakum infiltrasyonu ile daha önce ayrılmış yapraklar¹⁸ için optimize edilmiş koşullarla planta geçici ekspresyonunda ilk kez rapor ettik ve burada kakaoda planta geçici ekspresyonunda ilkini rapor ediyoruz.

Protokol

1. Agrobacterium tumefaciens kültürü

1. Agrobacterium tumefaciens suşu LBA4404'nin elektroyetkin hücrelerini çözün.
2. 1 mL maya malt ekleyin (YM; Tablo 1) 17 mm x 100 mm'lik bir kültür tüpüne et suyu. Bu tüpü daha sonrası için saklayın ve oda sıcaklığında (RT) saklayın.
3. 1.5 mL'lik bir mikrofüj tüpüne, 30 μL çözülmüş Agrobacterium hücresi ve 35S:RUBY içeren 100-250 ng (5 μL'ye kadar) DNA ekleyin. Yavaşça karıştırın.
   NOT: 35S:RUBY , Yunde Zhao'nun hediyesiydi. Numune arkını önlemek için, iyonik bileşiklerin varlığını mümkün olduğunca azaltın. Bu iyonik bileşikler, DNA^19'un etanol çökelmesinden kalan tuzlar olabilir.
4. Bu noktada, buz üzerine 1 mm'lik bir elektroporasyon küveti yerleştirin.
5. Önceki süspansiyon karışımını soğutulmuş 1 mm'lik bir elektroporasyon küvetine aktarın. Her şeyi buz üzerinde tutun. Küvetin metalik elektrotlarını silin.
6. Elektroporatörü Agr'ye (2.2 kV, ~5 ms, 1 darbe) ayarlayın. Küveti elektroporasyon odasının içine yerleştirin.
7. Darbe düğmesine basın. Nabız parametrelerini kaydedin. Numune ark yaparsa, elektroporasyon işlemi başarısız olur.
   NOT: Nabızdan hemen sonra hücrelerin hızlı bir şekilde YM suyuna aktarılması çok önemlidir. Bu aktarımın geciktirilmesi, dönüşüm verimliliğini önemli ölçüde azaltabilir²⁰.
8. Hücreleri küvetten 17 mm x 100 mm'lik tüpe aktarmak için hemen kaydedilen YM suyunu kullanın. Hücreleri yavaşça yeniden askıya alın.
9. Dönüştürülmüş hücreleri bir orbital inkübatörde 28 ° C ve 250 rpm'de 3 saat inkübe edin.
   NOT: Bu kültürde antibiyotik yoktur; Uygun aseptik koşullar konusunda dikkatli olun.
10. Bu kültürü seçici YM agar plakalarına^{sürün 21}. Dönüştürülmüş LBA4404-RUBY suşu için, bu plakaların rifampisin (25 μg/mL), spektinomisin (50 μg/mL) ve streptomisin (50 μg/mL) içerdiğinden emin olun. Bu plakayı gece boyunca 28 °C ayakta duran bir inkübatörde inkübe edin.
    NOT: Bu protokolde, spektinomisine (50 μg/mL) karşı bakteriyel direnç sağlayan ve sızan bitki dokusu üzerinde görsel bir raportör olarak işlev gören 35S:RUBY vektörü kullanılmıştır.
11. Gece kültüründen kolonileri 12.5 mL YM suyu ve Luria Bertani (LB) suyu karışımı (sırasıyla 9:1 oranında), 10 mM MES, pH 5.7²² üzerine aşılayın. Bu seçici sıvı ortamın adım 1.10'da kullanılan antibiyotiklerin aynısını içerdiğinden emin olun. Bu ortamların bileşenlerini ve konsantrasyonlarını görmek için Tablo 1'e bakın.
    1. Agrobacterium'u inkübe ederken, kültür için sıvı hacminin yaklaşık 4 ila 5 katı kadar havalandırma alanı bırakın. Hücre topaklanmasını önlemek için Agrobacterium suşu LBA4404 için YM suyu kullanın²³.
12. Kültürü 28 ° C'lik bir orbital inkübatörde 250 rpm'de 16 saat inkübe edin.
13. Kültürü, adım 1.11'de kullanılan ortamla başlangıç hacminin 10 katına kadar ölçeklendirin.
14. Kültürü 28 ° C'lik bir orbital inkübatörde 16 saat ve 250 rpm inkübe edin.
15. Gece kültürünü 0,4'lük bir optik yoğunluğa (OD₆₀₀) ayarlayın. 20 μM asetosiringon (AS) ekleyin.
16. OD 600 yaklaşık 1.0'a ulaşana kadar 28 ° C'lik bir orbital inkübatörde₂₅₀ rpm'de inkübe edin.
17. Hücreleri 20 ° C'de 10 dakika boyunca 4 500 x g'da santrifüjleyin.
18. Pelet, OD_600'ü 0.6'ya ayarlayarak süspansiyon çözeltisi (10 mM MES, 10 mM MgCl₂, pH 5.7) ile yeniden süspanse edin. 200 μM AS²⁴ ekleyin.
    NOT: Süspansiyon çözeltisini 28 °C'de önceden inkübe edin. Süspansiyon çözeltisi eklendiğinde soğuksa, hücreler çökelir.
19. Bakteriyel süspansiyonu karanlık koşullarda ve 25 °C'de 2-24 saat bekletin. Ajitasyon gerekli değildir²².

2. Bitki seçimi

1. Agroinfiltrasyon için en uygun aşamada yaprakları olan bir dalı olan bir bitki seçin.
   NOT: Bitki tam büyümüş veya olgun bir ağaç olabilir. Kakao için C evresinin genç yaprakları tavsiye edilir. Bu yapraklar bronz ila açık yeşil renklidir; tam olarak genişlemiş veya D evresi^{yaprakları 25} kadar katı değildirler (Şekil 1).
   1. Bir kontrol olarak, kullanılan suş ve vektör için rapor edilen yüksek bir agroinfiltrasyon verimliliği ile diğer bitkiler (örneğin, Nicotiana tabacum) üzerinde aynı anda agroinfiltrasyon gerçekleştirin.
      NOT: Bu kontrolde herhangi bir pozitif sonuç alınamazsa, negatif sonuçların suş veya kullanılan vektörden kaynaklanması mümkündür.

3. Vakum odası kurulumu

1. Bir vakum odası olarak, içindeki vakum basıncını ölçmek için vakum ölçere sahip bir desikatör kullanın.
2. Adım 1.19'dan itibaren Agrobacterium süspansiyonuna 250 μM Jasmonik asit (JA)^18,26 ekleyin.
3. Seçilen dalı ve yaprakları daldırmak için Agrobacterium kültürünü geniş ağızlı bir behere aktarın. Ardından, Agrobacterium kültürü içeren kabı desikatörün içine yerleştirin.
4. Dalı kurutucu ile kapağı arasına yerleştirin. İstenilen yaprakları Agrobacterium kültürünün içine daldırdığınızdan emin olun. Ardından, bitki dalının desikatöre girmesine izin veren kesikli yuvarlak bir halka olan bir atlama halkası kullanın. Atlama Halkası ayrıca Desikatörün alt ve üst kısmı arasında bir ara parça görevi görür.
5. Contanın, kapakla ezilmeyi önleyecek kadar yapısal olarak sağlam, bükülecek ve desikatörün çevresine göre ayarlanacak kadar esnek olduğundan ve gözenekli bir malzemeden yapılmadığından emin olun.
   NOT: Bu çalışmada, contaya benzeyen gözeneksiz plastik bir malzeme ile kaplanmış, birlikte bükülmüş birkaç küçük telden oluşan çok telli bir metal tel kullanılmıştır (Şekil 2).
6. Dalı desikatöre sabitlemek için silikon baskı malzemesi kullanın. Malzemenin yapışkan, gözeneksiz, kimyasal olarak desikatöre ve bitkiye inert olduğundan ve dal, conta ve desikatör arasındaki küçük boşlukları uygulaması ve doldurması kolay olduğundan emin olun.
7. Silikon baskı malzemesi polimerize olduğunda (bu yaklaşık 1 dakika sürer) ve dalı yerine sabitlediğinde, desikatörü kapatın. Boşluk bırakmadığınızdan emin olun.
8. Kurutucuyu vakum pompasına bağlayın (Şekil 3).

4. Vakum sızması

1. Vakum pompasını -0.07 MPa'ya ulaşana kadar çalıştırın.
2. Bu basınca ulaştığında, basınç valfini kapatın ve vakum pompasını kapatın. Bu basıncı 5 dakika koruyun.
3. Hazne basıncını eski haline getirmek için basınç valfini açın.
   NOT: Bu kritik bir adımdır. Hazne basıncını kademeli ve sabit bir şekilde geri yükleyin. Desikatörün tamamen yeniden basınçlandırılması 3 dakika kadar sürebilir. Uzun süreli yeniden basınçlandırma, doku içine sızan bakteri sayısını artırır¹⁰.
4. Bu işlemi iki kez daha tekrarlayın.
5. Dalı hücre süspansiyonundan ve desikatörden çıkarın.
6. Sızan yaprakları damıtılmış suyla temizleyin.

5. Sızan yaprakların inkübasyonu

1. Sızan yaprakların 25 °C'de 48 saat karanlık koşullarda kalmasına izin verin.
2. Ardından, sızan dokuyu 16/8 saatlik açık / koyu fotoperiyoda maruz bırakın.
3. Enfeksiyondan 3-7 gün sonra (DPI) geçici yaprak dönüşümünü değerlendirin.

Şekil 1: Kakao yapraklarının gelişim aşamaları. (A-E) Gelişim aşamaları²⁵. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Vakum odası konfigürasyonu ve bileşenleri. Vakum odası, bir vakum göstergesine bağlı bir desikatördür. Conta / O-ring, dalın yerleştirileceği bir açıklığa sahip olacak şekilde kesilir. (A) Vakum göstergesi, (B) Kapak, (C) Conta / O-ring, (D) Basınç valfi, (E) Desikatör, (F) Hortum. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Planta vakumlu agroinfiltrasyon sisteminde. Sızma işlemi sırasında vakum kayıplarını önlemek için, dalın kurutucuya ve contaya/O-ringe silikon baskı malzemesi ile sabitlenmesi çok önemlidir. (A) Kakao bitkisi, (B) Vakum odası, (C) Silikon baskı malzemesi, (D) Agrobacterium süspansiyonuna batırılmış yapraklar, (E) Vakum pompası. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Bu protokol, büyük boyutlu odunsu bitkiler için etkili bir agroinfiltrasyon yöntemi sunar. Bu protokolle, -0,07 MPa'lık bir vakum basıncı elde edebildik, bu da kakao yapraklarının etkili, lokalize infiltrasyonu ile sonuçlandı. Şekil 4'te, sızma sistemi kurulum sürecini ve Şekil 5'te son yapılandırmayı gözlemliyoruz.

Tartışmalar

Bu çalışmada, örnek olarak kakao bitkilerini kullanarak, odunsu bitkilerin planta geçici dönüşümü için verimli, düşük maliyetli bir agroinfiltrasyon protokolü sunduk. Yaprakların kütikülünün bitki dokularının dönüşümü için temsil ettiği iyi bilinen kısıtlama göz önüne alındığında, genellikle bu prosedüre karşı inatçı olan odunsu bitkilerde vakumla agroinfiltrasyonu kolaylaştırmak için bir strateji geliştirmeye odaklandık.

Vakum odası i?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
35S:RUBY plasmid	Addgene	160908	http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908
1 mm electroporation cuvette	Thermo Fisher Scientific	FB101	Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus
Desiccator	Bel-Art SP SCIENCEWARWE	F42400-2121
Freeze dryer	LABCONCO	700402040
K2HPO4	Sigma Aldrich	P8281-500G	For YM medium add 0.38 g/L
LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium	Intact Genomics USA	1285-12	https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/
Mannitol	Sigma Aldrich	63560-250G-F	For YM medium add 10 g/L
MES	Sigma Aldrich	PHG0003	(For LB, YM and resuspension medium) add 1.95 g/L (10mM)
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266	For resuspension medium add 0.952 g/L (10 mM)
MgSO4·7H20	Sigma Aldrich	63138-1KG	For YM medium add 0.204 g/L
MicroPulser Electroporation Apparatus	Biorad	165-2100
NaCl	Karal	60552	For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.1 g/L
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	13-400-518
President Silicone Impression material	COLTENE	60019938
Rifampicin	Gold-Bio	R-120-1	(100 mg/mL)
Silicone Impression material gun	Andent	TBT06
Spectinomycin	Gold-Bio	S-140-SL10	(100 mg/mL)
Streptomycin	Gold-Bio	S-150-SL10	(100 mg/mL)
Tryptone enzymatic digest from casein	Sigma Aldrich	95039-1KG-F	For LB medium add 10 g/L
Yeast extract	MCD LAB	9031	For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.4 g/L