Agroinfiltración forzada al vacío para la transformación in planta de plantas recalcitrantes: el cacao como caso de estudio

Resumen

En este trabajo presentamos el primer protocolo de infiltración localizada al vacío para estudios in vivo de la transformación genética de plantas de gran tamaño. Utilizando esta metodología, logramos por primera vez la transformación transitoria del cacao mediada por Agrobacterium in planta .

Resumen

La transformación transitoria en planta es una alternativa rápida y rentable para la transformación genética de plantas. La mayoría de los protocolos para la transformación in planta se basan en el uso de la transformación mediada por Agrobacterium. Sin embargo, los protocolos actualmente en uso están estandarizados para plantas de pequeño tamaño debido a las limitaciones físicas y económicas de someter plantas de gran tamaño a un tratamiento de vacío. En este trabajo se presenta un protocolo efectivo para la agroinfiltración localizada al vacío personalizada para plantas de gran tamaño. Para evaluar la eficacia del método propuesto, probamos su uso en plantas de cacao, una especie de planta tropical recalcitrante a la transformación genética. Nuestro protocolo permitió aplicar hasta 0,07 MPa de vacío, con repeticiones, a una parte aérea localizada de las hojas de cacao, posibilitando forzar la infiltración de Agrobacterium en los espacios intercelulares de las hojas adheridas. Como resultado, logramos la transformación transitoria mediada por Agrobacterium en la planta de las hojas de cacao adheridas que se expresan para el sistema reportero RUBY. Esta es también la primera transformación transitoria del cacao mediada por Agrobacterium. Este protocolo permitiría la aplicación del método de agroinfiltración al vacío a otras especies de plantas con limitaciones de tamaño similares y abriría la puerta a la caracterización in planta de genes en especies leñosas recalcitrantes de gran tamaño.

Introducción

Los métodos de transformación genética de las plantas son esenciales para probar las funciones biológicas de los genes y son especialmente útiles hoy en día, dado el gran número de genes no caracterizados que se predijeron en la era postgenómica¹. Estos métodos se pueden utilizar para obtener líneas completamente transformadas o para expresar genes de forma transitoria. La transformación estable ocurre cuando el ADN extraño que el huésped ha absorbido se integra completa e irreversiblemente en el genoma del huésped, y las modificaciones genéticas se transmiten a las generaciones posteriores. La expresión transitoria, conocida como transformació....

Protocolo

1. Cultivo de Agrobacterium tumefaciens

1. Descongelación de células electrocompetentes de Agrobacterium tumefaciens cepa LBA4404.
2. Agregue 1 mL de malta de levadura (YM; Tabla 1) caldo a un tubo de cultivo de 17 mm x 100 mm. Guarde este tubo para más tarde y manténgalo a temperatura ambiente (RT).
3. En un tubo de microfuga de 1,5 ml, agregue 30 μl de las células de Agrobacterium descongeladas y 100-250 ng (hasta 5 μl) del ADN que contiene 35S:RUBY. Mezclar suavemente.
   NOTA: El 35S:RUBY fue un regalo de Yunde Zhao. Para evitar la formación de arc....

Discusión

En este trabajo, presentamos un protocolo de agroinfiltración eficiente y de bajo costo para la transformación transitoria in planta de plantas leñosas, utilizando como ejemplo las plantas de cacao. Dada la conocida restricción que representa la cutícula de las hojas para la transformación de los tejidos vegetales, nos concentramos en desarrollar una estrategia para facilitar la agroinfiltración por vacío en plantas leñosas, que suelen ser recalcitrantes a este procedimiento.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
35S:RUBY plasmid	Addgene	160908	http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908
1 mm electroporation cuvette	Thermo Fisher Scientific	FB101	Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus
Desiccator	Bel-Art SP SCIENCEWARWE	F42400-2121
Freeze dryer	LABCONCO	700402040
K2HPO4	Sigma Aldrich	P8281-500G	For YM medium add 0.38 g/L
LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium	Intact Genomics USA	1285-12	https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/
Mannitol	Sigma Aldrich	63560-250G-F	For YM medium add 10 g/L
MES	Sigma Aldrich	PHG0003	(For LB, YM and resuspension medium) add 1.95 g/L (10mM)
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266	For resuspension medium add 0.952 g/L (10 mM)
MgSO4·7H20	Sigma Aldrich	63138-1KG	For YM medium add 0.204 g/L
MicroPulser Electroporation Apparatus	Biorad	165-2100
NaCl	Karal	60552	For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.1 g/L
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	13-400-518
President Silicone Impression material	COLTENE	60019938
Rifampicin	Gold-Bio	R-120-1	(100 mg/mL)
Silicone Impression material gun	Andent	TBT06
Spectinomycin	Gold-Bio	S-140-SL10	(100 mg/mL)
Streptomycin	Gold-Bio	S-150-SL10	(100 mg/mL)
Tryptone enzymatic digest from casein	Sigma Aldrich	95039-1KG-F	For LB medium add 10 g/L
Yeast extract	MCD LAB	9031	For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.4 g/L