Вакуум-принудительная агроинфильтрация для трансформации in planta непокорных растений: какао как тематическое исследование

Резюме

Здесь мы представляем первый протокол локализованной вакуумной инфильтрации для исследований in vivo генетической трансформации крупномерных растений. Используя эту методологию, мы впервые добились Agrobacterium-опосредованной в planta транзиторной трансформации какао.

Аннотация

Переходная трансформация растений является быстрой и экономичной альтернативой генетической трансформации растений. Большинство протоколов трансформации in planta основаны на использовании трансформации, опосредованной агробактериями. Тем не менее, используемые в настоящее время протоколы стандартизированы для малогабаритных установок из-за физических и экономических ограничений, связанных с вакуумной обработкой крупногабаритных установок. В данной работе представлен эффективный протокол локализованной вакуумной агроинфильтрации, адаптированный для крупнокалиберных растений. Для оценки эффективности предложенного метода мы протестировали его применение на растениях какао – тропическом виде растений, невосприимчивом к генетической трансформации. Наш протокол позволял применять вакуум до 0,07 МПа, с повторениями, к локализованной надземной части листьев какао, что позволяло форсировать инфильтрацию Agrobacterium в межклеточные пространства прикрепленных листьев. В результате мы добились Agrobacterium-опосредованной транзиентной трансформации planta прикрепленных листьев какао, экспрессирующей для репортерной системы RUBY. Это также первый случай транзиторной трансформации какао, опосредованный агробактериями. Этот протокол позволит применить метод вакуумной агроинфильтрации к другим видам растений с аналогичными размерными ограничениями и откроет дверь для характеристики генов in planta у непокорных древесных крупноразмерных видов.

Введение

Методы генетической трансформации растений имеют важное значение для проверки биологических функций генов и особенно полезны сегодня, учитывая большое количество неохарактеризованных генов, предсказанных в постгеномную^эпоху. Эти методы могут быть использованы для получения полностью трансформированных линий или для экспрессии генов на переходной основе. Стабильная трансформация происходит, когда чужеродная ДНК, принятая хозяином, полностью и необратимо интегрируется в геном хозяина, и генетические модификации передаются последующим поколениям. Транзиторная экспрессия, известная как транзиторная трансформация, происходит из нескольких копий Т-ДНК, перенесенных агробактериями в клетку, которые не были интегрированы в геном хозяина, и достигает пика через 2-4 дня^{после заражения}.

Стоит отметить, что анализы транзиторной экспрессии часто достаточны для функциональной характеристики генов и могут предложить ряд преимуществ по сравнению со стабильной трансформацией. Например, транзиторная трансформация не требует процедур регенерации на основе культуры тканей. Еще одно преимущество заключается в том, что он совместим с функциональным анализом генов in planta , существующим несколькими успешными примерами протоколов, хорошо стандартизированных для модельных видов растений, таких как Arabidopsis thaliana³ и Nicotiana benthamiana⁴, но все еще ограниченных для немодельных видов⁵.

Развитие транзиторных анализов зависит от наличия эффективных методов переноса генов. Для этого наиболее популярные подходы основаны на инфильтрации Agrobacterium , которая использует уникальную способность Agrobacterium переносить ДНК в клетки растений⁶. Другим полезным инструментом для такого анализа является использование репортерных генов, таких как зеленые флуоресцентные белки (GFP), β-глюкуронидаза (GUS), люцифераза или RUBY, которые используются для отслеживания трансформационных событий. Среди этих репортерных систем RUBY в настоящее время является самой простой для визуализации и основана на превращении тирозина в беталаины посредством трех ферментативных реакций. В отличие от других репортерных систем, полученные беталаины можно легко наблюдать в виде ярко окрашенных пигментов на трансформированных растительных тканях без необходимости использования сложного оборудования или дополнительных реагентов⁷.

При инфильтрации суспензии Agrobacterium в межклеточное пространство мезофилла листа наиболее критическим этапом для успешной агроинфекции является преодоление физического барьера, накладываемого эпидермальной кутикулой листьев⁸. В то время как для некоторых растений градиент давления, создаваемый безыгольным шприцем (шприцевая агроинфильтрация), достаточен для эффективной агроинфильтрации, как это происходит у Nicotiana benthamiana⁹, другим видам растений может потребоваться больший градиент давления, например, тот, который создается с помощью вакуумных насосов¹⁰. При вакуумных процессах агроинфильтрация происходит в два этапа. В первом случае вакуум служит для того, чтобы подвергнуть растительный материал пониженному давлению, заставляя выделять газы из воздушных пространств мезофилла через устьица и раны. Затем, во время фазы регерметизации, суспензия Agrobacterium проникает в межклеточные пространства через устьица и ранит¹¹.

По сравнению с инфильтрацией шприцем, вакуумная инфильтрация обеспечивает более высокую частоту использования, воспроизводимость и возможность контролировать давление и продолжительность на каждом этапе процесса инфильтрации¹⁰. В листьях различных видов растений, таких как шпинат (Spinacia oleracea)¹², пион (древесный многолетник) (Paeonia ostii)¹³ и вигна (Vigna unguiculata)¹⁴, протоколы вакуумной агроинфильтрации достигали более высокой скорости инфильтрации, чем инфильтрация шприцем. Аналогичным образом, у томатов (Lycopersicon esculentum)¹⁵ и гербер (Gerbera hybrida)¹⁶ вакуумная агроинфильтрация приводила к более сильному и равномерному подавлению генов, чем шприцевая инфильтрация. Дополнительным преимуществом вакуумной инфильтрации является меньшая зависимость от генотипа по сравнению со шприцевой инфильтрацией, которая недавно наблюдалась у трех сортов цитрусовых (Fortunella obovata, Citrus limon и C. grandis)¹⁷. Однако при попытке применить вакуумную агроинфильтрацию к растениям, которые слишком велики, чтобы поместиться в эксикаторы, размер вакуумных камер может быть ограничением, как это обычно происходит с тропическими древесными растениями.

Ниже мы опишем протокол, который преодолевает пространственные ограничения вакуумных камер, проверяя его полезность для переходной трансформации листьев какао in planta . Мы представляем первый локализованный метод вакуумной инфильтрации какао, который не требует дополнительного оборудования и даже позволяет использовать те же лабораторные эксикаторы, что и для инфильтрации всего растения, но с простой адаптацией, позволяющей получить доступ к части растения внутри вакуумной камеры, что позволяет использовать его на разных стадиях развития растения. Чтобы проверить полезность предложенного метода локализованной вакуумной инфильтрации, мы выбрали какао в качестве аналога крупнолистного тропического вида растений, который трудно трансформировать. Используя этот метод локализованной инфильтрации, мы недавно сообщили о первой транзиторной экспрессии растений в авокадо путем вакуумной инфильтрации, опосредованной агробактериями, с условиями, ранее оптимизированными для отделившихся листьев¹⁸, и здесь мы сообщаем о первой транзиторной экспрессии в planta у какао.

протокол

1. Культура Agrobacterium tumefaciens

1. Размораживание электрокомпетентных клеток штамма Agrobacterium tumefaciens LBA4404.
2. Добавьте 1 мл дрожжевого солода (YM; Таблица 1) бульон в культуральную пробирку размером 17 мм х 100 мм. Сохраните эту пробирку на потом и храните при комнатной температуре (RT).
3. В пробирку с микрофугой объемом 1,5 мл добавляют 30 мкл размороженных клеток Agrobacterium и 100-250 нг (до 5 мкл) ДНК, содержащей 35S:RUBY. Аккуратно перемешайте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 35S:RUBY был подарком от Юньдэ Чжао. Чтобы избежать возникновения дуги в образце, максимально уменьшите присутствие ионных соединений. Эти ионные соединения могут быть остаточными солями, образующимися в результате осаждения этанолом ДНК¹⁹.
4. На этом этапе поместите на лед электропорационную кювету диаметром 1 мм.
5. Перелейте предыдущую суспензионную смесь в охлажденную кювету для электропорации диаметром 1 мм. Держите все на льду. Протрите металлические электроды кюветы.
6. Установите электропоратор на Agr (2,2 кВ, ~5 мс, 1 импульс). Поместите кювету внутрь электропорационной камеры.
7. Нажмите кнопку Pulse . Зарегистрируйте параметры импульса. Если на образце вспыхнула дуга, процесс электропорации не удался.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно быстро перенести клетки в бульон YM сразу после импульса. Отсрочка этого переноса может резко снизить эффективность преобразования²⁰.
8. Немедленно используйте сэкономленный бульон YM для переноса клеток из кюветы в пробирку размером 17 мм x 100 мм. Аккуратно ресуспендируйте клетки.
9. Инкубируют трансформированные клетки в течение 3 ч при 28 °C и 250 об/мин на орбитальном инкубаторе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта культура не содержит антибиотиков; Будьте осторожны с надлежащими асептическими условиями.
10. Нанесите эту культуру на селективные агаровые пластины YM²¹. Для трансформированного штамма LBA4404-RUBY убедитесь, что эти планшеты содержат рифампицин (25 мкг/мл), спектиномицин (50 мкг/мл) и стрептомицин (50 мкг/мл). Инкубируйте эту пластину в течение ночи в инкубаторе со стоячей температурой 28 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе использовался вектор 35S:RUBY , который придает устойчивость бактерий к спектиномицину (50 мкг/мл) и функционирует как визуальный репортер на инфильтрированных растительных тканях.
11. Высевают колонии из ночной культуры на 12,5 мл смеси отвара YM и бульона Luria Bertani (LB) (в пропорции 9:1 соответственно), 10 мМ MES, pH 5,7²². Убедитесь, что эта селективная жидкая среда содержит те же антибиотики, которые использовались на шаге 1.10. В таблице 1 приведены ингредиенты и концентрации этих сред.
    1. При инкубации агробактерий оставьте для культуры достаточно места для аэрации, примерно в 4-5 раз превышающее объем жидкости. Используйте отвар YM для LBA4404 штамма Agrobacterium , чтобы избежать слипания клеток²³.
12. Инкубируют культуру в течение 16 ч при 250 об/мин на орбитальном инкубаторе с температурой 28 °C.
13. Увеличьте культуру до 10 раз по сравнению с исходным объемом с помощью той же среды, которая использовалась на шаге 1.11.
14. Инкубируют культуру в течение 16 ч при 250 об/мин на орбитальном инкубаторе с температурой 28 °C.
15. Отрегулируйте ночную культуру до оптической плотности (OD₆₀₀), равной 0,4. Добавьте 20 мкМ ацетосирингона (АС).
16. Инкубируйте при 250 об/мин на орбитальном инкубаторе с температурой 28 °C, пока наружный диаметр₆₀₀ не достигнет примерно 1,0.
17. Центрифугируют клетки при 4 500 x g в течение 10 мин при 20 °C.
18. Ресуспендируйте гранулы с помощью суспензионного раствора (10 мМ MES, 10 мМ MgCl₂, pH 5,7), регулируя наружный диаметр₆₀₀ до 0,6. Добавьте 200 мкМ AS²⁴.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно инкубируйте раствор суспензии при температуре 28 °C. Если суспензионный раствор при добавлении холодный, клетки выпадут в осадок.
19. Оставьте бактериальную суспензию на 2-24 ч в темных условиях и при температуре 25 °C. Агитация не требуется²².

2. Выбор растения

1. Выбирайте растение с веткой с листьями в оптимальной стадии для агроинфильтрации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Растение может быть взрослым или взрослым деревом. Для какао рекомендуются молодые листья стадии С. Эти листья имеют бронзовый или светло-зеленый цвет; они не полностью расширены и не так жестки, как листья^{стадии D 25} (рис. 1).
   1. В качестве контроля одновременно проводят агроинфильтрацию на других растениях (например, Nicotiana tabacum) с высокой эффективностью агроинфильтрации, которая сообщается для используемого штамма и переносчика.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если в этом контроле не получено положительных результатов, возможно, отрицательные результаты связаны с деформацией или используемым вектором.

3. Настройка вакуумной камеры

1. В качестве вакуумной камеры используйте эксикатор с вакуумметром для измерения вакуумного давления внутри.
2. Добавьте 250 мкМ жасмоновой кислоты (JA)^18,26 к суспензии Agrobacterium, начиная с шага 1.19.
3. Перенесите культуру Agrobacterium в стакан с широким горлышком, чтобы погрузить выбранную ветку и листья. Затем поместите стакан с культурой Agrobacterium внутрь эксикатора.
4. Поместите ветку между эксикатором и его крышкой. Обязательно погрузите желаемые листья внутрь культуры Agrobacterium . Далее используют прыгающее кольцо, которое представляет собой круглое кольцо с вырезом, позволяющим ветке растения входить в эксикатор. Прыгающее кольцо также действует как прокладка между нижней и верхней частями сушильщика.
5. Убедитесь, что прокладка достаточно стабильна, чтобы избежать сдавливания крышкой, достаточно гибкая, чтобы сгибаться и регулироваться по окружности эксикатора, и не изготовлена из пористого материала.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовался многожильный металлический провод, состоящий из нескольких скрученных вместе проволок меньшего размера, покрытых непористым пластиковым материалом, напоминающим прокладку (Рисунок 2).
6. Чтобы закрепить ветку на эксикаторе, используйте силиконовый оттискной материал. Убедитесь, что материал липкий, непористый, химически инертный к эксикатору и растению, а также легко наносится и заполняет небольшие зазоры между ветвью, прокладкой и эксикатором.
7. Как только силиконовый оттискной материал полимеризуется (это занимает около 1 минуты) и закрепит ветку на месте, закройте эксикатор. Следите за тем, чтобы не оставалось зазоров.
8. Подключите эксикатор к вакуумному насосу (Рисунок 3).

4. Вакуумная инфильтрация

1. Запускайте вакуумный насос до тех пор, пока он не достигнет -0,07 МПа.
2. Как только он достигнет этого давления, закройте напорный клапан и выключите вакуумный насос. Поддерживайте это давление в течение 5 минут.
3. Откройте напорный клапан, чтобы восстановить давление в камере.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это очень важный шаг. Постепенно и неуклонно восстанавливайте давление в камере. Для полного повышения давления в эксикаторе может потребоваться до 3 минут. Длительное повторное давление увеличивает количество бактерий, проникающих внутрь ткани¹⁰.
4. Повторите этот процесс еще два раза.
5. Снимите ветку с клеточной суспензии и эксикатора.
6. Пропитанные листья промыть дистиллированной водой.

5. Инкубация инфильтрированных листьев

1. Оставьте инфильтрированные листья в темных условиях при температуре 25 °C в течение 48 часов.
2. Затем подвергните инфильтрированную ткань 16/8-часовому световому/темному фотопериоду.
3. Оцените транзиторную трансформацию листьев через 3-7 дней после заражения (DPI).

Рисунок 1: Какао покидает стадии развития. (А-Е) Стадии развития²⁵. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Конфигурация вакуумной камеры и ее компонентов. Вакуумная камера представляет собой эксикатор, соединенный с вакуумметром. Прокладка / уплотнительное кольцо обрезается таким образом, чтобы в нем было отверстие, куда будет помещена ветка. (A) Вакуумметр, (B) Крышка, (C) Прокладка / уплотнительное кольцо, (D) Напорный клапан, (E) Сушилка, (F) Шланг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: В системе вакуумной агроинфильтрации planta . Чтобы избежать потерь вакуума в процессе инфильтрации, очень важно закрепить ответвление на эксикаторе и прокладку/уплотнительное кольцо силиконовым оттискным материалом. (A) Растение какао, (B) Вакуумная камера, (C) Силиконовый оттискной материал, (D) Листья, погруженные в суспензию Agrobacterium , (E) Вакуумный насос. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты

Данный протокол представляет собой эффективный метод агроинфильтрации для крупноплодных древесных растений. С помощью этого протокола мы смогли достичь вакуумного давления -0,07 МПа, что привело к эффективной, локализованной инфильтрации листьев какао. На рисунке 4 пок?...

Обсуждение

В этой работе мы представили эффективный, недорогой протокол агроинфильтрации для переходной трансформации древесных растений in planta на примере растений какао. Учитывая хорошо известное ограничение, которое кутикула листьев представляет для трансформации тканей растений, мы сос...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
35S:RUBY plasmid	Addgene	160908	http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908
1 mm electroporation cuvette	Thermo Fisher Scientific	FB101	Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus
Desiccator	Bel-Art SP SCIENCEWARWE	F42400-2121
Freeze dryer	LABCONCO	700402040
K2HPO4	Sigma Aldrich	P8281-500G	For YM medium add 0.38 g/L
LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium	Intact Genomics USA	1285-12	https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/
Mannitol	Sigma Aldrich	63560-250G-F	For YM medium add 10 g/L
MES	Sigma Aldrich	PHG0003	(For LB, YM and resuspension medium) add 1.95 g/L (10mM)
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266	For resuspension medium add 0.952 g/L (10 mM)
MgSO4·7H20	Sigma Aldrich	63138-1KG	For YM medium add 0.204 g/L
MicroPulser Electroporation Apparatus	Biorad	165-2100
NaCl	Karal	60552	For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.1 g/L
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	13-400-518
President Silicone Impression material	COLTENE	60019938
Rifampicin	Gold-Bio	R-120-1	(100 mg/mL)
Silicone Impression material gun	Andent	TBT06
Spectinomycin	Gold-Bio	S-140-SL10	(100 mg/mL)
Streptomycin	Gold-Bio	S-150-SL10	(100 mg/mL)
Tryptone enzymatic digest from casein	Sigma Aldrich	95039-1KG-F	For LB medium add 10 g/L
Yeast extract	MCD LAB	9031	For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.4 g/L