Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يمثل التلاعب بتداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) تحديا هائلا في العديد من الأنواع الطفيلية ذات الحجم الصغير ، مثل دبابير Trichogramma . حددت هذه الدراسة طريقة RNAi فعالة في Trichogramma denrolimi. توفر المنهجية الحالية نموذجا قويا للتحقيق في تنظيم الجينات في دبابير Trichogramma .

Abstract

يتم التعرف على طفيليات البيض ، Trichogramma spp ، كعوامل مكافحة بيولوجية فعالة ضد مختلف آفات حرشفيات الأجنحة في الزراعة والغابات. تتطور المراحل غير الناضجة من نسل Trichogramma داخل البويضة المضيفة ، وتظهر ضآلة ملحوظة (حوالي 0.5 مم في طول البالغين). برزت منهجية تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) كأداة حاسمة لتوضيح وظائف الجينات في العديد من الكائنات الحية. ومع ذلك ، فإن التلاعب بالحمض النووي الريبي في بعض الأنواع الطفيلية الصغيرة ، مثل Trichogramma ، قد شكل تحديات كبيرة بشكل عام. في هذه الدراسة ، نقدم طريقة RNAi فعالة في Trichogramma denrolimi. يشمل الإجراء المحدد الحصول على عينات T. dendrolimi الفردية وعزلها من بيض المضيف ، وتصميم وتوليف الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل (dsRNA) ، وزرع وزراعة الشرانق T. dendrolimi في المختبر ، والحقن الدقيق ل dsRNA ، والتقييم اللاحق للضربة القاضية الجينية المستهدفة من خلال تحليل RT-qPCR. توفر هذه الدراسة إجراء شاملا ومفصلا بصريا لإجراء تجارب RNAi في T. dendrolimi ، مما يمكن الباحثين من التحقيق في تنظيم الجينات في هذا النوع. علاوة على ذلك ، فإن هذه المنهجية قابلة للتكيف مع دراسات RNAi أو الحقن الدقيقة في أنواع Trichogramma الأخرى مع تعديلات طفيفة ، مما يجعلها مرجعا قيما لإجراء تجارب RNAi في الأنواع الطفيلية الداخلية الأخرى.

Introduction

Trichogramma spp. هي مجموعة من طفيليات البيض التي تم استخدامها على نطاق واسع كعوامل مكافحة بيولوجية عالية الكفاءة ضد مجموعة واسعة من الآفات حرشفية الأجنحة في النظم الإيكولوجية الزراعية والغابات في جميع أنحاء العالم1،2،3،4. يوفر تطبيق Trichogramma الذي يتم تربيته على نطاق واسع نهجا صديقا للبيئة للإدارة المستدامة للآفات5،6،7. يوفر فهم البيولوجيا الجزيئية لدبابير Trichogramma رؤى قيمة لتعزيز كفاءة التربية الجماعية والأداء الميداني لعوامل المكافحة البيولوجية هذه 8,9 من خلال التحقيق في منهجية تنظيم الجينات وتحرير الجينوم10.

منذ اكتشاف التداخل الجيني المحدد المزدوج الشريط (dsRNA) بوساطة Caenorhabditis elegans في عام 1998 ، تطورت طريقة تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) إلى مجموعة أدوات وراثية حيوية لاستكشاف الآليات التنظيمية للكائنات الحية عن طريق قمع التعبير عن الجينات المستهدفة11. أصبحت تجارب RNAi منهجية قياسية مطبقة على نطاق واسع لدراسة وظيفة الجينات في العديد من أنواع الحشرات12,13. ومع ذلك ، فإن التلاعب بالحمض النووي الريبي يمثل تحديا هائلا في العديد من الأنواع الطفيلية ، لا سيما بين تلك التي تنتمي إلى عائلة Chalcidoidea الطفيليةالداخلية 14،15،16. تم توثيق طريقة RNAi في ما لا يقل عن 13 نوعا طفيليا14،15،16،17،18،19. من بين هذه ، تم إجراء نهج RNAi بشكل شامل في دبابير Nasonia وهو قابل للتطبيق طوال مراحل النمو ، بما في ذلك الأجنة واليرقات والشرانق والبالغين14،15،16. من الجدير بالذكر أن دبابير Nasonia هي طفيليات خارجية ، حيث يتطور نسلها في الفضاء الخلالي بين الخادرة المضيفة و puparium ، مما يتيح زراعتها في المختبر ويجعلها تتحمل علاجات معينة ، مثل الحقن الدقيق. على عكس دبابير ناسونيا ، يخضع أفراد Trichogramma لتطورهم الجنيني واليرقات والعذراء بالكامل داخل البويضة المضيفة. تمثل الطبقة في مراحل الجنين واليرقات (التي قد تعيق نفاذية dsRNA) ، والتعرض للتلف ، وصعوبة البقاء على قيد الحياة في المختبر عقبات هائلة20،21،22. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الحجم الصغير لأفراد Trichogramma ، حوالي ~ 0.5 مم في طول البالغين أو العذراء ، يجعلهم معقدين للغاية للتلاعبب 20،21،22.

في هذه الدراسة ، نحدد إجراء شاملا لإجراء تجارب تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) في Trichogramma denrolimi Matsumura. يشمل هذا الإجراء الإجراءات التالية: (1) تصميم وتوليف الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل (dsRNA) ، (2) الحقن المجهري لشرانق T. denrolimi ، (3) زرع هذه الشرانق وتحضينها في المختبر ، و (4) الكشف عن ضربة قاضية للجين المستهدف من خلال تحليل RT-qPCR. الجين المستهدف المختار لتجربة RNAi هو تماثل سلسلة الفيريتين الثقيلة (Ferhch). يحتوي FerHCH ، وهو بروتين ملزم للحديد ، على مركز فيروكسيديز يتمتع بقدرات مضادة للأكسدة ، مما يسهل أكسدة Fe2+ إلى Fe3+. يلعب دورا لا غنى عنه في نمو وتطور الكائنات الحية المختلفة من خلال الحفاظ على توازن الأكسدة والاختزال وتوازن الحديد. ويمكن أن يؤدي استنفاد سداسي كلور حلقي الهكسان إلى الإفراط في تراكم الحديد، مما يؤدي إلى تلف الأنسجة بشكل لا رجعة فيه، وغالبا ما يبلغ ذروته في تغيرات كبيرة في النمط الظاهري، بما في ذلك عيوب النمو والتشوهات والوفيات23 و24. تقدم هذه الدراسة دليلا خطوة بخطوة لإجراء RNAi في T. denrolimi ، والذي سيكون لا يقدر بثمن للتحقيق في وظائف الجينات في السياق الأوسع لدبابير Trichogramma.

Protocol

ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والأدوات والبرامج والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. جمع وصيانة زراعة الحشرات

  1. قم بلصق مجموعة من ~ 5000 بيضة من Corcyra cephalonica (Stainton) على بطاقة 9 سم × 16 سم باستخدام محلول 1: 5 (v / v) من مسحوق الصمغ العربي والماء25,26.
    ملاحظة: تجنب إرفاق الكثير من بيض المضيف بالبطاقة لأن الاكتظاظ يجعلها غير عملية لإجراءات النقل والتشريح اللاحقة.
  2. لمنع فقس بيض المضيف ، قم بإخضاع بطاقات البيض المضيفة لمدة 30 دقيقة من الأشعة فوق البنفسجية (الشكل 1-i). بعد ذلك ، قم بتقطيع الورق بالبيض المعطل إلى بطاقات بيض يبلغ سمكها 1 سم وقطرها 8 سم ، تحتوي كل منها على حوالي 300-500 بيضة (الشكل 1-ii)25،26،27.
  3. أدخل مجموعة من الدبابير 80-120 T. denrolimi في أنبوب زجاجي يبلغ قطره 2 سم وطوله 8 سم. ختم الأنبوب بالقطن.
    ملاحظة: الحفاظ على الدبابير عند درجة حرارة 25 ± 1 درجة مئوية ، مع دورة الضوء / الظلام من 16 ساعة من الضوء و 8 ساعات من الظلام والحفاظ على رطوبة نسبية تبلغ حوالي 75٪.
  4. قدم بطاقة بيضة مضيفة إلى الدبابير للتطفل (الشكل 1-ii). اسمح للدبابير بإيداع بيضها في البيض المضيف لمدة 6 ساعات ، وبعد ذلك قم بإزالة الدبابير على الفور.
    ملاحظة: تجنب إطالة فترة التطفل بشكل مفرط لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى اكتظاظ نسل T. denrolimi داخل البويضة المضيفة ، مما يؤدي إلى زيادة معدل وفيات دبابير النسل28,29.

2. تخليق dsRNA

  1. تصميم مجموعات التمهيدي التي تحتوي على مروج T7 لتوليف الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل (dsRNA). اختر شريحة 300-400 bp من الجين المستهدف (Ferhch) لتخليق dsRNA.
  2. الحصول على مجموعات أولية مركبة تجاريا لإنتاج dsRNA للجين المستهدف و dsGFP لاستخدامها كعنصر تحكم سلبي.
  3. استخرج محتوى الحمض النووي الريبي من 100 دبابير T. denrolimi باستخدام المجموعة المشار إليها باتباع بروتوكولالشركة المصنعة 9. تحقق من جودة محتوى الحمض النووي الريبي ؛ تابع إذا كانت قيمة OD260 / OD280 تتراوح من 1.8 إلى 2.09.
  4. قم بتنقية محتوى الحمض النووي الريبي باستخدام 2 ميكرولتر من المخزن المؤقت 5x (1 وحدة / 50 ميكرولتر) ، و 1 ميكرولتر من DNAse (1 وحدة / 50 ميكرولتر) ، و 6.5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي (~ 100 نانوغرام / ميكرولتر) ، 0.5 ميكرولتر من H2O عند 42 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
  5. إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي (RT-PCR) لإنشاء قالب cDNA مع 10 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المنقى (~ 100 نانوغرام / ميكرولتر) ، 4 ميكرولتر من 5x buffer (1 U / 50 μL) ، 1 ميكرولتر من مزيج الإنزيم I (1 U / 50 μL) ، و 4 ميكرولتر من H2O. قم بإجراء RT-PCR باستخدام الإعدادات التالية: 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، 85 درجة مئوية لمدة 5 ثوان. قم بتخزين منتج cDNA في درجة حرارة -4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  6. إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتضخيم تسلسلات dsRNA وفقا للمزيج الرئيسي المشار إليه (10 ميكرولتر من Taq II [1 U / 50 μL] ، 0.8 ميكرولتر من التمهيدي الأمامي [0.4 μM] ، 0.8 ميكرولتر من التمهيدي العكسي [0.4 ميكرومتر] ، 0.8 ميكرولتر من قالب الحمض النووي [40 نانوغرام / ميكرولتر] ، و 7.6 ميكرولتر من H2O). إجراء PCR باستخدام الإعدادات التالية: 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ؛ 35 دورة مع 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 30 ؛ 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
  7. تقييم جودة منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق الكهربائي على هلام الأغاروز 2.0٪ 5,9 وتأكيد التسلسل المستهدف من خلال تسلسل سانجر.
  8. قم بتنقية منتج PCR باستخدام مجموعة استخراج الجل وفقا لإرشادات الشركة المصنعة 9,23.
  9. استخدم نظام RNAi لتجميع dsRNA للجين المستهدف مع 10 ميكرولتر من 2x buffer (0.02 وحدة / ميكرولتر) ، و 8 ميكرولتر من قالب الحمض النووي (75 نانوغرام / ميكرولتر) ، و 2 ميكرولتر من مزيج الإنزيم (1 وحدة / 50 ميكرولتر) مع الإعدادات التالية: 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، و 25 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تخلص من dsRNA المركب ب 30 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز.
  10. قم بتقييم جودة منتج dsRNA من خلال تصوره على هلام أغاروز 1.0٪ 5,9. تمييع dsRNA إلى 7000 نانوغرام / ميكرولتر. تحقق من جودة منتج dsRNA ؛ تابع إذا كانت قيمة OD260 / OD280 تتراوح من 1.8 إلى 2.09. قم بتخزين منتج dsRNA في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

3. زرع الشرانق T. denrolimi

  1. قم بزراعة بيض المضيف المتطفل لمدة 8 أيام تقريبا عند 25 ± 1 درجة مئوية ، مع الحفاظ على دورة مظلمة لمدة 16 ساعة / 8 ساعات ورطوبة نسبية ~ 75٪. سوف يتحول لون البيض المضيف المتطفل إلى اللون الأسود بعد 5 أيام30 (الشكل 1-iv ، v).
  2. نقل بطاقة البيض المضيف إلى المجهر تشريح. استخدم زوجا من إبر التنغستن (الشكل 1-السادس) لإزالة المشيم بدقة من البيض المضيف (الشكل 1-السابع) واستعادة الخادرة من الداخل (الشكل 1-الثامن)5،17،18.
    ملاحظة: يجب أن يكون طرف إبرة التشريح أقل من 0.05 مم.
  3. إعداد لوحة نظيفة للركيزة. اسكب 10-15 مل من محلول أجار 15 جم / لتر ، مما يسمح له بالتبريد بشكل طبيعي (الشكل 2-ط).
    ملاحظة: امزج محلول أجار مع 0.5 جم من الستربتومايسين لمنع نمو الملوثات في المختبر.
  4. استخدم جرافا مطهرا لحفر عدة أخاديد بعمق 0.2-0.3 مم وعرض 0.4-0.8 مم (الشكل 2-ii).
  5. استخدم فرشاة صغيرة (الشكل 2-iii) لزرع خادرة من البويضة المضيفة المشرحة في أحد الأخاديد الموجودة على ركيزة الآجار (الشكل 2-iv).
  6. كرر الخطوتين 3.4 و 3.5 ، وزرع 100-300 خادرة بشكل فردي في الأخاديد واحدة تلو الأخرى (الشكل 2-v).

4. حقن دقيق ل dsRNA في T. denrolimi pupa

  1. استخدم مجتذب إبرة زجاجية لسحب الشعيرات الدموية الزجاجية (الشكل 3-i ، ii). اضبط الحرارة على 280 ، والسرعة على 170 ، والتأخير على 250 ، والسحب على 30 على مجتذب الإبرة (الشكل 3-iii). تحضير إبر زجاجية شعرية متعددة للحقن المجهري (الشكل 3-iv ، v).
  2. شطبة طرف الإبرة الزجاجية باستخدام لوحة كاشطة (الشكل 3-السادس).
    ملاحظة: تأكد من أن طرف إبرة الحقن لا يزال حادا ؛ خلاف ذلك ، قد يؤدي إلى وفيات العذراء أو إعاقة تدفق الكاشف عبر الإبرة (الشكل 3-السابع).
  3. قم بتحميل ما يقرب من 2 ميكرولتر من محلول حقن dsRNA مع 7000 نانوغرام / ميكرولتر في إبرة الحقن المعدة باستخدام مضخة حقن دقيقة (الشكل 3-السابع).
  4. انقل ركيزة الآجار التي تحتوي على مئات الشرانق إلى منصة المجهر المركب (الشكل 3-الثامن).
  5. أدخل إبرة الحقن بعناية في بطن خادرة T. denrolimi بزاوية ~ 30 درجة إلى البطن تحت العدسة (الشكل 3-التاسع).
  6. حقن تدريجيا ~ 5 nL من محلول الحقن (الخطوة 4.3) في خادرة T. denrolimi بلطف قدر الإمكان.
    ملاحظة: قد تنتفخ خادرة T. denrolimi قليلا عند حقن محلول dsRNA. قد يؤدي حقن كمية زائدة من المحلول في الخادرة أو استخدام الإبر ذات الفتحات الكبيرة جدا إلى موت العذراء المبكر. قم بتغيير الإبر عندما تصبح مسدودة بعد حقن عدة إلى عشرات الشرانق.
  7. كرر الخطوتين 4.5 و 4.6 ، حقن dsRNA في 600 خادرة واحدة تلو الأخرى.
    ملاحظة: لتحليل RT-qPCR الموثوق به ، يجب عزل محتوى الحمض النووي الريبي من 100 خادرة على الأقل. حقن ما لا يقل عن 600 خادرة لثلاث تكرارات في علاج dsRNA وثلاثة مكررات في التحكم السلبي dsGFP 9.

5. حضانة الشرانق T. denrolimi

  1. نقل الركيزة التي تحتوي على الشرانق المحقونة إلى حاضنة عند 25 ± 1 درجة مئوية مع دورة ضوء / ظلام 16 ساعة / 8 ساعات و ~ 75٪ رطوبة نسبية.
  2. احتضان ما يقرب من 700 T. denrolimi الشرانق لكل علاج لمدة 24 ساعة أو 48 ساعة. استخراج محتوى الحمض النووي الريبي من مجموعة من 100 خادرة لكل نسخة مكررة9.
    ملاحظة: إزالة الشرانق المنكمشة (الشرانق الميتة) من العينات; خلاف ذلك ، قد يؤدي إلى أخطاء في الكشف عن التعبير الجيني.
  3. احتضان ~ 50 T. denrolimi الشرانق لكل علاج حتى تظهر الدبابير (الشكل 3-x). سجل معدل الظهور ومعدل التشوه.

6. الكشف عن التعبير الجيني المستهدف

  1. صمم مجموعة التمهيدي للجين المستهدف والجينات المرجعية ل RT-qPCR باستخدام أداة تصميم.
    ملاحظة: تأكد من عدم تداخل تسلسلات بادئات RT-qPCR مع المنطقة المستهدفة من dsRNA.
  2. استخدام صندوق شوكة الجين O (FoxO) كجين مرجعي في تحليل RT-qPCR ؛ تم الإبلاغ عن الاشعال من FoxO سابقا9.
  3. الحصول على مجموعات التمهيدي توليفها تجاريا. قم بإجراء RT-qPCR مع 10 ميكرولتر من Taq II (1 U / 50 μL) ، 0.8 ميكرولتر من التمهيدي الأمامي (0.4 μM) ، 0.8 ميكرولتر من التمهيدي العكسي (0.4 ميكرومتر) ، 0.8 ميكرولتر من القالب (10 نانوغرام / ميكرولتر) ، و 7.6 ميكرولتر من H2O. قم بإجراء RT-qPCR باستخدام الإعدادات التالية: 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ 35 دورة مع 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوان ، 57 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 30 ؛ 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ؛ 60 درجة مئوية لمدة 5 ثوان ، و 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوان.
  4. احسب قيمة التعبير للجين المستهدف باستخدام طريقة 2-ΔΔCt 9,25.
  5. استخدم اختبار Kruskal-Wallis لتحليل التعبير عن الجين المستهدف تحت تأثير العلاجات المختلفة (dsFerhch ، dsGFP ، عدم الحقن).
    ملاحظة: تجنب استخدام الاختبارات البارامترية (على سبيل المثال ، اختبار t) للمقارنات اللاحقة لأن عدم تجانس البيانات وعدم طبيعتها قد يؤدي إلى استنتاجات خاطئة25.

النتائج

كان معدل ظهور الشرانق T. denrolimi المحقونة ب dsFerhch أقل بكثير من أولئك الذين تم حقنهم ب dsGFP أو أولئك الذين لم يحقنوا (الجدول 1). من بين الدبابير الناشئة ، 51.85 ٪ من الدبابير T. denrolimi التي تعرضت ل dsFerhch وضعت أجنحة صغيرة مشوهة. لم تلاحظ الدبابير المشوهة في الدبابير المحقو?...

Discussion

ومن المسلم به أن الدبابير Trichogramma هي عوامل مكافحة بيولوجية فعالة، وتستهدف على وجه التحديد مجموعة من الآفات حرشفية الأجنحة في الزراعة والحراجة1. تخضع هذه الدبابير الصغيرة لمراحلها غير الناضجة داخل البويضة المضيفة ، وهي خاصية تمثل تحديات في إجراء تجارب RNAi 5,...

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم تمويل هذا البحث من قبل مشاريع المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32172476 ، 32102275) ، وبرنامج ابتكار العلوم والتكنولوجيا الزراعية (CAAS-ZDRW202203 ، CAAS-ZDRW202108) ، والصناديق المركزية التي توجه تطوير العلوم والتكنولوجيا المحلية (XZ202301YD0042C).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2x ES Taq MasterMix (Dye)Cowin Biotech, ChinaCW0690HTo amplify the dsRNA sequences
20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6)Sangon Biotech, ChinaB540627-0500To dilute dsRNA
Agar stripShishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, Chinan/aTo make culture medium
Ampicillin sodiumSangon Biotech, ChinaA610028To make culture medium
Bioer Constant temperature metal bath BIOER, ChinaMB-102To synthesis dsRNA
Borosilicate glass capillary WPI, USA1B100-4To pull capillary glass needle
Clean bench Airtech, ChinaSW-CJ-1FDTo extract RNA
Double distilled waterSangon Biotech, ChinaA500197-0500To dilute cDNA
Environmental Testing chamber Panasonic, JapanMLR-352H-PCTo culture T. denrolimi
Eppendorf Centrifuge Eppendrof, Germany5418RTo store RNA content
Eppendorf FemtoJet 4iEppendrof, GermanyFemtoJet 4iTo inject T. denrolimi
Eppendorf Refrigerated Centrifuge Eppendrof, Germany5810RCentrifuge
Ethanol solution (75%, RNase-free)Aladdin, ChinaM052131-500mlTo extract RNA
Gel Extraction KitOmega, USAD25000-02To extract cDNA
GUM ArabicSolarbio, ChinaCG5991-500gTo make egg card
Isopropyl alchoholAladdin, China80109218To extract RNA
Laser-Based Micropipette Puller SUTTER, USAP-2000To pull capillary glass needle
Microloader Eppendrof, Germany20 µLTo load dsRNA
Multi-sample tissue grinder LICHEN, ChinaLC-TG-24To grind T. denrolimi
Needle Grinder SUTTER, USABV-10-ETo grind capillary glass needle
Nuclease-Free WaterSangon Biotech, ChinaTo dilute RNA
OLYMPUS MicroscopeOLYMPUS, JapanXZX16To observe T. denrolimi
PCR machine Bio-rad, USAS-1000For DNA amplification
PowerPac BasicBio-rad, USAPowerPacTM BasicTo detect the quality of dsRNA 
Primer of dsGFP (Forward)[TAATACGACTCACTATAGGG]
ACAAACCAAGGCAAGTAATA
Primer of dsGFP (Reverse)[TAATACGACTCACTATAGGG]
CAGAGGCATCTTCAACG
Primer of Ferhch for qPCR (Forward)TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT
Primer of Ferhch for qPCR (Reverse)CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT
Primer of Ferhch for RNAi (Reverse)[TAATACGACTCACTATAGGG]AG
TAGCCATCATCTTTCC
Primer of Ferhch for RNAi(Forward)[TAATACGACTCACTATAGGG]
ACACTGTCAATCGTCCTG
Primer of FoxO for qPCR (Forward)CTACGCCGATCTCATAACGC
Primer of FoxO for qPCR (Reverse)TGCTGTCGCCCTTGTCCT
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)TaKaRa, JapanRR047A
Quantitative Real-time PCR Bio-rad, USACFX 96 TouchTo perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) 
Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Toolhttps://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/
T7 RiBoMAX Express RNAi SystemPromega, USAP1700To synthesis dsRNA  in vitro 
TB Green Premix Ex TaqTM figure-materials-5268 (Til RnaseH Plus)TaKaRa, JapanRR820ATo perform RT-qPCR
TrichloromethaneKESHI, ChinaGB/T682-2002To extract RNA
TRIzol ReagentAmbion, USA15596018To extract total RNA content from samples
Ultra-low Temperature Freezer Thermo, USAForma 911

References

  1. Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status and perspectives. Annu Rev Entomol. 66, 463-484 (2020).
  2. Zhou, J. C., et al. Optimal clutch size for quality control of bisexual and Wolbachia-infected thelytokous lines of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) mass reared on eggs of a substitutive host, Antheraea pernyi Guérin-Méneville (Lepidoptera: Saturniidae). Pest Manag Sci. 76 (8), 2635-2644 (2020).
  3. Li, T. H., et al. Current status of the biological control of the fall armyworm Spodoptera frugiperda by egg parasitoids. J Pest Sci. 96, 1345-1363 (2023).
  4. Zhou, J. C., et al. Effects of temperature and superparasitism on quality and characteristics of thelytokous Wolbachia-infected Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) during mass rearing. Sci Rep. 9 (1), 18114 (2019).
  5. Zhou, J. C., et al. Penetrance during Wolbachia-mediated parthenogenesis of Trichogramma wasps is reduced by continuous oviposition, associated with exhaustion of Wolbachia titers in ovary and offspring eggs. Pest Manag Sci. 78 (7), 3080-3089 (2022).
  6. Huang, N. X., et al. Long-term and large-scale releases of Trichogramma promote pesticide decrease in maize in northeastern China. Entomol Gen. 40 (4), 331-335 (2020).
  7. Wang, P., et al. Performance of Trichogramma japonicum as a vector of Beauveria bassiana for parasitizing eggs of rice striped stem borer, Chilo suppressalis. Entomol Gen. 41 (2), 147-155 (2021).
  8. Ning, S. F., et al. The identification and expression pattern of the sex determination genes and their sex-specific variants in the egg parasitoid Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae). Front Physiol. 14, 1243753 (2023).
  9. Huo, L. X., et al. Selection and evaluation of RT-qPCR reference genes for expression analysis in the tiny egg parasitoid wasp, Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae). J Asia Pac Entomol. 25 (2), 101883 (2022).
  10. Leung, K., et al. Next-generation biological control: the need for integrating genetics and genomics. Biol Rev Camb Philos Soc. 95 (6), 1838-1854 (2020).
  11. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  12. Leonard, S. P., et al. Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens. Science. 367 (6477), 573-576 (2020).
  13. Sun, Y., et al. Silencing an essential gene involved in infestation and digestion in grain aphid through plant-mediated RNA interference generates aphid-resistant wheat plants. Plant Biotechnol J. 17 (5), 852-854 (2019).
  14. Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation. J Vis Exp. 130, e56990 (2017).
  15. Dalla Benetta, E., Chaverra-Rodriguez, D., Rasgon, J. L., Akbari, O. S. Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis. J Vis Exp. 166, e61892 (2020).
  16. Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nat Protoc. 1 (1), 486-494 (2006).
  17. Zhu, K. Y., Palli, S. R. Mechanisms, Applications, and Challenges of Insect RNA Interference. Annu Rev Entomol. 65, 293-311 (2020).
  18. Colinet, D., et al. Development of RNAi in a Drosophila endoparasitoid wasp and demonstration of its efficiency in impairing venom protein production. J Insect Physiol. 63, 56-61 (2014).
  19. Wang, B., et al. A digestive tract expressing α-amylase influences the adult lifespan of Pteromalus puparum revealed through RNAi and rescue analyses. Pest Manag Sci. 75 (12), 3346-3355 (2019).
  20. Zhou, J. C., et al. Wolbachia-infected Trichogramma dendrolimi is outcompeted by its uninfected counterpart in superparasitism but does not have developmental delay. Pest Manag Sci. 79 (3), 1005-1017 (2023).
  21. Zhou, J. C., et al. Posterior concentration of Wolbachia during the early embryogenesis of the host dynamically shapes the tissue tropism of Wolbachia in host Trichogramma wasps. Front Cell Infect Microbiol. 13, 1198428 (2023).
  22. Lee, T. Y. The development of Trichogramma evanescens Westw. and its influence on the embryonic development of its host, Attacus cynthia ricini Boisd. Acta Entomol Sin Z. 11 (1), 89-119 (1961).
  23. Shen, Y., Chen, Y. Z., Zhang, C. X. RNAi-mediated silencing of genes in the brown planthopper Nilaparvata lugens affects survival, growth and female fecundity. Pest Manag Sci. 77 (1), 365-377 (2021).
  24. Wu, S., Yin, S., Zhou, B. Molecular physiology of iron trafficking in Drosophila melanogaster. Curr Res Insect Sci. 50, 100888 (2022).
  25. Zhou, J. C., et al. Wolbachia-Driven Memory Loss in a Parasitic Wasp Increases Superparasitism to Enhance Horizontal Transmission. mBio. 13 (6), e0236222 (2022).
  26. Ning, S. F., Zhou, J. C., Liu, Q. Q., Zhao, Q., Dong, H. Gradual, temperature-induced change of secondary sexual characteristics in Trichogramma pretiosum infected with parthenogenesis-inducing Wolbachia. PeerJ. 7, e7567 (2019).
  27. Zhang, C., et al. Decreased Wolbachia titers cause gradual change in masculinization of intersex individuals of thelytokous Trichogramma dendrolimi. Entomol Gen. 42 (5), 751-759 (2022).
  28. Zhang, X., et al. Multi-parasitism: A promising approach to simultaneously produce Trichogramma chilonis and T. dendrolimi on eggs of Antheraea pernyi. Entomol Gen. 41 (6), 627-636 (2021).
  29. Zhou, J. C., et al. Effects of Thelytokous parthenogenesis-inducing Wolbachia on the fitness of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) in superparasitised and single-parasitised hosts. Front Ecol Evol. 9, 730664 (2021).
  30. Flanders, S. E. Notes on the life history and anatomy of Trichogramma. Ann Entomol Soc Am. 30 (2), 304-308 (1937).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

201

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved