A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
يمثل التلاعب بتداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) تحديا هائلا في العديد من الأنواع الطفيلية ذات الحجم الصغير ، مثل دبابير Trichogramma . حددت هذه الدراسة طريقة RNAi فعالة في Trichogramma denrolimi. توفر المنهجية الحالية نموذجا قويا للتحقيق في تنظيم الجينات في دبابير Trichogramma .
يتم التعرف على طفيليات البيض ، Trichogramma spp ، كعوامل مكافحة بيولوجية فعالة ضد مختلف آفات حرشفيات الأجنحة في الزراعة والغابات. تتطور المراحل غير الناضجة من نسل Trichogramma داخل البويضة المضيفة ، وتظهر ضآلة ملحوظة (حوالي 0.5 مم في طول البالغين). برزت منهجية تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) كأداة حاسمة لتوضيح وظائف الجينات في العديد من الكائنات الحية. ومع ذلك ، فإن التلاعب بالحمض النووي الريبي في بعض الأنواع الطفيلية الصغيرة ، مثل Trichogramma ، قد شكل تحديات كبيرة بشكل عام. في هذه الدراسة ، نقدم طريقة RNAi فعالة في Trichogramma denrolimi. يشمل الإجراء المحدد الحصول على عينات T. dendrolimi الفردية وعزلها من بيض المضيف ، وتصميم وتوليف الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل (dsRNA) ، وزرع وزراعة الشرانق T. dendrolimi في المختبر ، والحقن الدقيق ل dsRNA ، والتقييم اللاحق للضربة القاضية الجينية المستهدفة من خلال تحليل RT-qPCR. توفر هذه الدراسة إجراء شاملا ومفصلا بصريا لإجراء تجارب RNAi في T. dendrolimi ، مما يمكن الباحثين من التحقيق في تنظيم الجينات في هذا النوع. علاوة على ذلك ، فإن هذه المنهجية قابلة للتكيف مع دراسات RNAi أو الحقن الدقيقة في أنواع Trichogramma الأخرى مع تعديلات طفيفة ، مما يجعلها مرجعا قيما لإجراء تجارب RNAi في الأنواع الطفيلية الداخلية الأخرى.
Trichogramma spp. هي مجموعة من طفيليات البيض التي تم استخدامها على نطاق واسع كعوامل مكافحة بيولوجية عالية الكفاءة ضد مجموعة واسعة من الآفات حرشفية الأجنحة في النظم الإيكولوجية الزراعية والغابات في جميع أنحاء العالم1،2،3،4. يوفر تطبيق Trichogramma الذي يتم تربيته على نطاق واسع نهجا صديقا للبيئة للإدارة المستدامة للآفات5،6،7. يوفر فهم البيولوجيا الجزيئية لدبابير Trichogramma رؤى قيمة لتعزيز كفاءة التربية الجماعية والأداء الم....
ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والأدوات والبرامج والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. جمع وصيانة زراعة الحشرات
كان معدل ظهور الشرانق T. denrolimi المحقونة ب dsFerhch أقل بكثير من أولئك الذين تم حقنهم ب dsGFP أو أولئك الذين لم يحقنوا (الجدول 1). من بين الدبابير الناشئة ، 51.85 ٪ من الدبابير T. denrolimi التي تعرضت ل dsFerhch وضعت أجنحة صغيرة مشوهة. لم تلاحظ الدبابير المشوهة في الدبابير المحقو?.......
ومن المسلم به أن الدبابير Trichogramma هي عوامل مكافحة بيولوجية فعالة، وتستهدف على وجه التحديد مجموعة من الآفات حرشفية الأجنحة في الزراعة والحراجة1. تخضع هذه الدبابير الصغيرة لمراحلها غير الناضجة داخل البويضة المضيفة ، وهي خاصية تمثل تحديات في إجراء تجارب RNAi 5,.......
يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.
تم تمويل هذا البحث من قبل مشاريع المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32172476 ، 32102275) ، وبرنامج ابتكار العلوم والتكنولوجيا الزراعية (CAAS-ZDRW202203 ، CAAS-ZDRW202108) ، والصناديق المركزية التي توجه تطوير العلوم والتكنولوجيا المحلية (XZ202301YD0042C).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
2x ES Taq MasterMix (Dye) | Cowin Biotech, China | CW0690H | To amplify the dsRNA sequences |
20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6) | Sangon Biotech, China | B540627-0500 | To dilute dsRNA |
Agar strip | Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China | n/a | To make culture medium |
Ampicillin sodium | Sangon Biotech, China | A610028 | To make culture medium |
Bioer Constant temperature metal bath | BIOER, China | MB-102 | To synthesis dsRNA |
Borosilicate glass capillary | WPI, USA | 1B100-4 | To pull capillary glass needle |
Clean bench | Airtech, China | SW-CJ-1FD | To extract RNA |
Double distilled water | Sangon Biotech, China | A500197-0500 | To dilute cDNA |
Environmental Testing chamber | Panasonic, Japan | MLR-352H-PC | To culture T. denrolimi |
Eppendorf Centrifuge | Eppendrof, Germany | 5418R | To store RNA content |
Eppendorf FemtoJet 4i | Eppendrof, Germany | FemtoJet 4i | To inject T. denrolimi |
Eppendorf Refrigerated Centrifuge | Eppendrof, Germany | 5810R | Centrifuge |
Ethanol solution (75%, RNase-free) | Aladdin, China | M052131-500ml | To extract RNA |
Gel Extraction Kit | Omega, USA | D25000-02 | To extract cDNA |
GUM Arabic | Solarbio, China | CG5991-500g | To make egg card |
Isopropyl alchohol | Aladdin, China | 80109218 | To extract RNA |
Laser-Based Micropipette Puller | SUTTER, USA | P-2000 | To pull capillary glass needle |
Microloader | Eppendrof, Germany | 20 µL | To load dsRNA |
Multi-sample tissue grinder | LICHEN, China | LC-TG-24 | To grind T. denrolimi |
Needle Grinder | SUTTER, USA | BV-10-E | To grind capillary glass needle |
Nuclease-Free Water | Sangon Biotech, China | To dilute RNA | |
OLYMPUS Microscope | OLYMPUS, Japan | XZX16 | To observe T. denrolimi |
PCR machine | Bio-rad, USA | S-1000 | For DNA amplification |
PowerPac Basic | Bio-rad, USA | PowerPacTM Basic | To detect the quality of dsRNA |
Primer of dsGFP (Forward) | [TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA | ||
Primer of dsGFP (Reverse) | [TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG | ||
Primer of Ferhch for qPCR (Forward) | TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT | ||
Primer of Ferhch for qPCR (Reverse) | CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT | ||
Primer of Ferhch for RNAi (Reverse) | [TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC | ||
Primer of Ferhch for RNAi(Forward) | [TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG | ||
Primer of FoxO for qPCR (Forward) | CTACGCCGATCTCATAACGC | ||
Primer of FoxO for qPCR (Reverse) | TGCTGTCGCCCTTGTCCT | ||
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) | TaKaRa, Japan | RR047A | |
Quantitative Real-time PCR | Bio-rad, USA | CFX 96 Touch | To perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) |
Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Tool | https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/ | ||
T7 RiBoMAX Express RNAi System | Promega, USA | P1700 | To synthesis dsRNA in vitro |
TB Green Premix Ex TaqTM ![]() | TaKaRa, Japan | RR820A | To perform RT-qPCR |
Trichloromethane | KESHI, China | GB/T682-2002 | To extract RNA |
TRIzol Reagent | Ambion, USA | 15596018 | To extract total RNA content from samples |
Ultra-low Temperature Freezer | Thermo, USA | Forma 911 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved