A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يمثل التلاعب بتداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) تحديا هائلا في العديد من الأنواع الطفيلية ذات الحجم الصغير ، مثل دبابير Trichogramma . حددت هذه الدراسة طريقة RNAi فعالة في Trichogramma denrolimi. توفر المنهجية الحالية نموذجا قويا للتحقيق في تنظيم الجينات في دبابير Trichogramma .

Abstract

يتم التعرف على طفيليات البيض ، Trichogramma spp ، كعوامل مكافحة بيولوجية فعالة ضد مختلف آفات حرشفيات الأجنحة في الزراعة والغابات. تتطور المراحل غير الناضجة من نسل Trichogramma داخل البويضة المضيفة ، وتظهر ضآلة ملحوظة (حوالي 0.5 مم في طول البالغين). برزت منهجية تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) كأداة حاسمة لتوضيح وظائف الجينات في العديد من الكائنات الحية. ومع ذلك ، فإن التلاعب بالحمض النووي الريبي في بعض الأنواع الطفيلية الصغيرة ، مثل Trichogramma ، قد شكل تحديات كبيرة بشكل عام. في هذه الدراسة ، نقدم طريقة RNAi فعالة في Trichogramma denrolimi. يشمل الإجراء المحدد الحصول على عينات T. dendrolimi الفردية وعزلها من بيض المضيف ، وتصميم وتوليف الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل (dsRNA) ، وزرع وزراعة الشرانق T. dendrolimi في المختبر ، والحقن الدقيق ل dsRNA ، والتقييم اللاحق للضربة القاضية الجينية المستهدفة من خلال تحليل RT-qPCR. توفر هذه الدراسة إجراء شاملا ومفصلا بصريا لإجراء تجارب RNAi في T. dendrolimi ، مما يمكن الباحثين من التحقيق في تنظيم الجينات في هذا النوع. علاوة على ذلك ، فإن هذه المنهجية قابلة للتكيف مع دراسات RNAi أو الحقن الدقيقة في أنواع Trichogramma الأخرى مع تعديلات طفيفة ، مما يجعلها مرجعا قيما لإجراء تجارب RNAi في الأنواع الطفيلية الداخلية الأخرى.

Introduction

Trichogramma spp. هي مجموعة من طفيليات البيض التي تم استخدامها على نطاق واسع كعوامل مكافحة بيولوجية عالية الكفاءة ضد مجموعة واسعة من الآفات حرشفية الأجنحة في النظم الإيكولوجية الزراعية والغابات في جميع أنحاء العالم1،2،3،4. يوفر تطبيق Trichogramma الذي يتم تربيته على نطاق واسع نهجا صديقا للبيئة للإدارة المستدامة للآفات5،6،7. يوفر فهم البيولوجيا الجزيئية لدبابير Trichogramma رؤى قيمة لتعزيز كفاءة التربية الجماعية والأداء الم....

Protocol

ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والأدوات والبرامج والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. جمع وصيانة زراعة الحشرات

  1. قم بلصق مجموعة من ~ 5000 بيضة من Corcyra cephalonica (Stainton) على بطاقة 9 سم × 16 سم باستخدام محلول 1: 5 (v / v) من مسحوق الصمغ العربي والماء25,26.
    ملاحظة: تجنب إرفاق الكثير من بيض المضيف بالبطاقة لأن الاكتظاظ يجعلها غير عملية لإجراءات النقل والتشريح اللاحقة.
  2. لمنع فقس بيض المضيف ، قم بإخضاع بطاقات البيض المضيفة لمدة 30 دقيقة من الأشعة فوق البنفسجية (

النتائج

كان معدل ظهور الشرانق T. denrolimi المحقونة ب dsFerhch أقل بكثير من أولئك الذين تم حقنهم ب dsGFP أو أولئك الذين لم يحقنوا (الجدول 1). من بين الدبابير الناشئة ، 51.85 ٪ من الدبابير T. denrolimi التي تعرضت ل dsFerhch وضعت أجنحة صغيرة مشوهة. لم تلاحظ الدبابير المشوهة في الدبابير المحقو?.......

Discussion

ومن المسلم به أن الدبابير Trichogramma هي عوامل مكافحة بيولوجية فعالة، وتستهدف على وجه التحديد مجموعة من الآفات حرشفية الأجنحة في الزراعة والحراجة1. تخضع هذه الدبابير الصغيرة لمراحلها غير الناضجة داخل البويضة المضيفة ، وهي خاصية تمثل تحديات في إجراء تجارب RNAi 5,.......

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم تمويل هذا البحث من قبل مشاريع المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32172476 ، 32102275) ، وبرنامج ابتكار العلوم والتكنولوجيا الزراعية (CAAS-ZDRW202203 ، CAAS-ZDRW202108) ، والصناديق المركزية التي توجه تطوير العلوم والتكنولوجيا المحلية (XZ202301YD0042C).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2x ES Taq MasterMix (Dye)Cowin Biotech, ChinaCW0690HTo amplify the dsRNA sequences
20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6)Sangon Biotech, ChinaB540627-0500To dilute dsRNA
Agar stripShishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, Chinan/aTo make culture medium
Ampicillin sodiumSangon Biotech, ChinaA610028To make culture medium
Bioer Constant temperature metal bath BIOER, ChinaMB-102To synthesis dsRNA
Borosilicate glass capillary WPI, USA1B100-4To pull capillary glass needle
Clean bench Airtech, ChinaSW-CJ-1FDTo extract RNA
Double distilled waterSangon Biotech, ChinaA500197-0500To dilute cDNA
Environmental Testing chamber Panasonic, JapanMLR-352H-PCTo culture T. denrolimi
Eppendorf Centrifuge Eppendrof, Germany5418RTo store RNA content
Eppendorf FemtoJet 4iEppendrof, GermanyFemtoJet 4iTo inject T. denrolimi
Eppendorf Refrigerated Centrifuge Eppendrof, Germany5810RCentrifuge
Ethanol solution (75%, RNase-free)Aladdin, ChinaM052131-500mlTo extract RNA
Gel Extraction KitOmega, USAD25000-02To extract cDNA
GUM ArabicSolarbio, ChinaCG5991-500gTo make egg card
Isopropyl alchoholAladdin, China80109218To extract RNA
Laser-Based Micropipette Puller SUTTER, USAP-2000To pull capillary glass needle
Microloader Eppendrof, Germany20 µLTo load dsRNA
Multi-sample tissue grinder LICHEN, ChinaLC-TG-24To grind T. denrolimi
Needle Grinder SUTTER, USABV-10-ETo grind capillary glass needle
Nuclease-Free WaterSangon Biotech, ChinaTo dilute RNA
OLYMPUS MicroscopeOLYMPUS, JapanXZX16To observe T. denrolimi
PCR machine Bio-rad, USAS-1000For DNA amplification
PowerPac BasicBio-rad, USAPowerPacTM BasicTo detect the quality of dsRNA 
Primer of dsGFP (Forward)[TAATACGACTCACTATAGGG]
ACAAACCAAGGCAAGTAATA
Primer of dsGFP (Reverse)[TAATACGACTCACTATAGGG]
CAGAGGCATCTTCAACG
Primer of Ferhch for qPCR (Forward)TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT
Primer of Ferhch for qPCR (Reverse)CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT
Primer of Ferhch for RNAi (Reverse)[TAATACGACTCACTATAGGG]AG
TAGCCATCATCTTTCC
Primer of Ferhch for RNAi(Forward)[TAATACGACTCACTATAGGG]
ACACTGTCAATCGTCCTG
Primer of FoxO for qPCR (Forward)CTACGCCGATCTCATAACGC
Primer of FoxO for qPCR (Reverse)TGCTGTCGCCCTTGTCCT
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)TaKaRa, JapanRR047A
Quantitative Real-time PCR Bio-rad, USACFX 96 TouchTo perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) 
Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Toolhttps://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/
T7 RiBoMAX Express RNAi SystemPromega, USAP1700To synthesis dsRNA  in vitro 
TB Green Premix Ex TaqTM figure-materials-5268 (Til RnaseH Plus)TaKaRa, JapanRR820ATo perform RT-qPCR
TrichloromethaneKESHI, ChinaGB/T682-2002To extract RNA
TRIzol ReagentAmbion, USA15596018To extract total RNA content from samples
Ultra-low Temperature Freezer Thermo, USAForma 911

References

  1. Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status and perspectives. Annu Rev Entomol. 66, 463-484 (2020).
  2. Zhou, J. C., et al.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

201

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved