卵寄生虫中的RNA干扰， Trichogramma dendrolimi Matsumura

Summary

RNA干扰（RNAi）的操纵在许多体型较小的寄生虫物种（如 黄蜂毛 滴虫）中提出了巨大的挑战。本研究描述了一种有效的 RNAi 方法。本方法为研究 毛滴 虫黄蜂的基因调控提供了一个稳健的模型。

Abstract

卵寄生虫（Trichogramma spp）被认为是针对农业和森林中各种鳞翅目害虫的有效生物防治剂。Trichogramma后代的未成熟阶段在宿主卵中发育，表现出显着的矮小（成体长度约为0.5毫米）。RNA干扰（RNAi）方法已成为阐明众多生物体基因功能的重要工具。然而，在某些小型寄生虫物种（如Trichogramma）中操纵RNAi通常带来了重大挑战。在这项研究中，我们提出了一种有效的 RNAi 方法。概述的程序包括从宿主卵中获取和分离单个 T. dendrolimi 标本、双链 RNA （dsRNA） 的设计和合成、T. dendrolimi 蛹的体外移植和培养、dsRNA 的显微注射，以及随后通过 RT-qPCR 分析评估靶基因敲低。本研究为在树状锥虫中进行RNAi实验提供了一个全面、视觉上详细的程序，从而使研究人员能够研究该物种的基因调控。此外，该方法适用于其他毛滴虫物种的RNAi研究或显微注射，只需稍作调整，使其成为在其他内寄生物种中进行RNAi实验的宝贵参考。

Introduction

毛滴虫属是一组卵类寄生虫，已被广泛用作高效生物防治剂，可对抗全球农业和森林生态系统中的各种鳞翅目害虫1,2,3,4。大规模饲养的Trichogramma的应用为害虫的可持续管理提供了一种环境友好的方法^5,6,7。通过研究基因调控和基因组编辑的方法¹⁰，了解毛滴虫的分子生物学，为提高这些生物^防治剂的批量饲养效率和田间性能提供了宝贵的见解^8,9。

自 1998 年在秀丽隐杆线虫中发现双链 RNA （dsRNA） 介导的特异性遗传干扰以来，RNA 干扰 （RNAi） 方法已发展成为通过抑制靶基因表达来探索生物体调控机制的重要遗传工具包¹¹。RNAi实验已成为一种标....

Protocol

注意：有关本协议中使用的所有材料、仪器、软件和试剂的详细信息 ，请参阅材料表 。

1. 昆虫培养物的收集和维护

1. 使用 1：5 （v/v） 阿拉伯胶粉和水^25,26 的溶液，将一组 ~5,000 个 Corcyra cephalonica （Stainton） 卵粘贴在 9 cm x 16 cm 的卡片上。
   注意：避免在卡片上附加过多的宿主卵，因为过度拥挤会使后续的转移和解剖程序变得不切实际。
2. 为了防止宿主卵孵化，将宿主卵卡置于30分钟的紫外线（UV）照射下（图1-i）。随后，将装有灭活鸡蛋的纸切成厚度为1厘米，直径为8厘米的鸡蛋卡，每张包含约300-500个鸡蛋（图1-ii）25,26,27。
3. 将一组 80-120 只 T. denr....

Discussion

Trichogramma黄蜂被认为是有效的生物防治剂，专门针对农业和林业中的一系列鳞翅目害虫¹。这些体型较小的黄蜂在宿主卵中经历其未成熟阶段，这一特征在进行 RNAi 实验时提出了挑战 ^5,18。本研究为在T. denrolimi中进行RNAi实验提供了全面的视觉指南。鉴于毛滴虫物种之间共有的生物学特征，该程序可以很容易地适用于?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x ES Taq MasterMix (Dye)	Cowin Biotech, China	CW0690H	To amplify the dsRNA sequences
20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6)	Sangon Biotech, China	B540627-0500	To dilute dsRNA
Agar strip	Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China	n/a	To make culture medium
Ampicillin sodium	Sangon Biotech, China	A610028	To make culture medium
Bioer Constant temperature metal bath	BIOER, China	MB-102	To synthesis dsRNA
Borosilicate glass capillary	WPI, USA	1B100-4	To pull capillary glass needle
Clean bench	Airtech, China	SW-CJ-1FD	To extract RNA
Double distilled water	Sangon Biotech, China	A500197-0500	To dilute cDNA
Environmental Testing chamber	Panasonic, Japan	MLR-352H-PC	To culture T. denrolimi
Eppendorf Centrifuge	Eppendrof, Germany	5418R	To store RNA content
Eppendorf FemtoJet 4i	Eppendrof, Germany	FemtoJet 4i	To inject T. denrolimi
Eppendorf Refrigerated Centrifuge	Eppendrof, Germany	5810R	Centrifuge
Ethanol solution (75%, RNase-free)	Aladdin, China	M052131-500ml	To extract RNA
Gel Extraction Kit	Omega, USA	D25000-02	To extract cDNA
GUM Arabic	Solarbio, China	CG5991-500g	To make egg card
Isopropyl alchohol	Aladdin, China	80109218	To extract RNA
Laser-Based Micropipette Puller	SUTTER, USA	P-2000	To pull capillary glass needle
Microloader	Eppendrof, Germany	20 µL	To load dsRNA
Multi-sample tissue grinder	LICHEN, China	LC-TG-24	To grind T. denrolimi
Needle Grinder	SUTTER, USA	BV-10-E	To grind capillary glass needle
Nuclease-Free Water	Sangon Biotech, China		To dilute RNA
OLYMPUS Microscope	OLYMPUS, Japan	XZX16	To observe T. denrolimi
PCR machine	Bio-rad, USA	S-1000	For DNA amplification
PowerPac Basic	Bio-rad, USA	PowerPacTM Basic	To detect the quality of dsRNA
Primer of dsGFP (Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA
Primer of dsGFP (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG
Primer of Ferhch for qPCR (Forward)			TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT
Primer of Ferhch for qPCR (Reverse)			CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT
Primer of Ferhch for RNAi (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC
Primer of Ferhch for RNAi(Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG
Primer of FoxO for qPCR (Forward)			CTACGCCGATCTCATAACGC
Primer of FoxO for qPCR (Reverse)			TGCTGTCGCCCTTGTCCT
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)	TaKaRa, Japan	RR047A
Quantitative Real-time PCR	Bio-rad, USA	CFX 96 Touch	To perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Tool			https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/
T7 RiBoMAX Express RNAi System	Promega, USA	P1700	To synthesis dsRNA  in vitro
TB Green Premix Ex TaqTM (Til RnaseH Plus)	TaKaRa, Japan	RR820A	To perform RT-qPCR
Trichloromethane	KESHI, China	GB/T682-2002	To extract RNA
TRIzol Reagent	Ambion, USA	15596018	To extract total RNA content from samples
Ultra-low Temperature Freezer	Thermo, USA	Forma 911