Interferencia de ARN en el parasitoide del huevo, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Resumen

La manipulación del ARN de interferencia (ARNi) presenta un desafío formidable en muchas especies de parasitoides con tamaño diminuto, como las avispas Trichogramma . Este estudio delineó un método eficiente de ARNi en Trichogramma denrolimi. La presente metodología proporciona un modelo robusto para investigar la regulación génica en avispas Trichogramma .

Resumen

Los parasitoides del huevo, Trichogramma spp, son reconocidos como agentes de control biológico eficientes contra diversas plagas de lepidópteros en la agricultura y los bosques. Las etapas inmaduras de la descendencia de Trichogramma se desarrollan dentro del huevo huésped, exhibiendo una notable diminución (aproximadamente 0,5 mm de longitud adulta). La metodología de ARN de interferencia (ARNi) se ha convertido en una herramienta crucial para dilucidar las funciones de los genes en numerosos organismos. Sin embargo, la manipulación del ARNi en ciertas especies de parasitoides pequeños, como Trichogramma, generalmente ha planteado desafíos significativos. En este estudio, presentamos un método eficiente de ARNi en Trichogramma denrolimi. El procedimiento descrito abarca la adquisición y el aislamiento de muestras individuales de T. dendrolimi a partir de óvulos del huésped, el diseño y la síntesis de ARN bicatenario (dsRNA), el trasplante in vitro y el cultivo de pupas de T. dendrolimi , la microinyección de dsRNA y la posterior evaluación de la eliminación del gen diana mediante el análisis RT-qPCR. Este estudio proporciona un procedimiento completo y visualmente detallado para realizar experimentos de ARNi en T. dendrolimi, lo que permite a los investigadores investigar la regulación génica en esta especie. Además, esta metodología es adaptable para estudios de ARNi o microinyecciones en otras especies de Trichogramma con pequeños ajustes, lo que la convierte en una referencia valiosa para la realización de experimentos de ARNi en otras especies endoparásitas.

Introducción

Trichogramma spp. es un grupo de parasitoides de huevos que han sido ampliamente utilizados como agentes de control biológico altamente eficientes contra un amplio espectro de plagas de lepidópteros en ecosistemas agrícolas y forestales en todo el mundo 1,2,3,4. La aplicación de Trichogramma criado en masa proporciona un enfoque respetuoso con el medio ambiente para el manejo sostenible de plagas ^5,6,7. La comprensión de la biología molecular de las avispas Trichogramma proporciona información valiosa para mejorar la eficiencia de la cría masiva y el rendimiento en el campo de estos agentes de control biológico ^8,9 mediante la investigación de la metodología de regulación génica y edición del genoma¹⁰.

Desde el descubrimiento de la interferencia genética específica mediada por ARN bicatenario (dsRNA) en Caenorhabditis elegans en 1998, el método de ARN de interferencia (ARNi) se ha convertido en un conjunto de herramientas genéticas vitales para explorar los mecanismos reguladores de los organismos mediante la supresión de la expresión de genes diana¹¹. Los experimentos con ARNi se han convertido en una metodología estándar ampliamente aplicada para estudiar la función génica en numerosas especies de insectos^12,13. Sin embargo, la manipulación del ARNi presenta un desafío formidable en muchas especies de parasitoides, particularmente entre las pertenecientes a la familia endoparásita Chalcidoidea 14,15,16. El método ARNi ha sido documentado en al menos 13 especies de parasitoides 14,15,16,17,18,19. Entre estos, el enfoque de ARNi se ha llevado a cabo de manera integral en avispas Nasonia y es aplicable a lo largo de las etapas de desarrollo, incluidos embriones, larvas, pupas y adultos 14,15,16. Cabe destacar que las avispas Nasonia son ectoparasitoides, y sus crías se desarrollan en el espacio intersticial entre la pupa huésped y el pupario, lo que permite su cultivo in vitro y las hace tolerar ciertos tratamientos, como la microinyección. A diferencia de las avispas Nasonia, los individuos de Trichogramma experimentan todo su desarrollo embrionario, larval y pupal dentro del huevo huésped. La capa en estadios embrionario y larvario (que puede impedir la permeabilidad del dsRNA), la vulnerabilidad al daño y la dificultad para sobrevivir in vitro presentan obstáculos formidables 20,21,22^. Además, el diminuto tamaño de los individuos de Trichogramma, aproximadamente ~0,5 mm de longitud adulta o pupa, los hace extremadamente intrincados para manipular 20,21,22.

En el presente estudio, describimos un procedimiento integral para realizar experimentos de ARN de interferencia (ARNi) en Trichogramma denrolimi Matsumura. Este procedimiento engloba los siguientes procedimientos: (1) el diseño y síntesis de ARN bicatenario (dsRNA), (2) microinyección de pupas de T. denrolimi, (3) el trasplante e incubación in vitro de estas pupas, y (4) la detección de knockdown de genes diana mediante análisis RT-qPCR. El gen diana seleccionado para el experimento de ARNi es la homología de cadena pesada de ferritina (Ferhch). El FerHCH, una proteína de unión al hierro, contiene un centro de ferroxidasa dotado de capacidades antioxidantes, lo que facilita la oxidación de Fe²⁺ a Fe³⁺. Desempeña un papel indispensable en el crecimiento y desarrollo de diversos organismos al mantener el equilibrio redox y la homeostasis del hierro. La depleción de FerHCH puede dar lugar a la acumulación excesiva de hierro, lo que conduce a daños irreversibles en los tejidos y, a menudo, culmina en alteraciones fenotípicas significativas, incluidos defectos de crecimiento, deformidades y mortalidad^23,24. Este estudio ofrece una guía paso a paso para realizar ARNi en T. denrolimi, que será invaluable para investigar las funciones génicas dentro del contexto más amplio de las avispas Trichogramma.

Protocolo

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, instrumentos, software y reactivos utilizados en este protocolo.

1. Recolección y mantenimiento del cultivo de insectos

1. Adherir un grupo de ~5.000 huevos de Corcyra cephalonica (Stainton) en una tarjeta de 9 cm por 16 cm utilizando una solución 1:5 (v/v) de goma arábiga en polvo y agua^25,26.
   NOTA: Evite colocar demasiados huevos del huésped en la tarjeta, ya que el hacinamiento hace que no sea práctico para los procedimientos posteriores de transferencia y disección.
2. Para evitar la eclosión de los huevos del huésped, someta las tarjetas de huevos del huésped a 30 minutos de irradiación ultravioleta (UV) (Figura 1-i). Posteriormente, corte el papel con huevos inactivados en tarjetas de huevo de 1 cm de grosor y 8 cm de diámetro, conteniendo cada una aproximadamente 300-500 huevos (Figura 1-ii)25,26,27.
3. Introducir una cohorte de 80-120 avispas T. denrolimi en un tubo de vidrio de 2 cm de diámetro y 8 cm de longitud. Sella el tubo con algodón.
   NOTA: Mantener las avispas a una temperatura de 25 ± 1 °C, con un ciclo de luz/oscuridad de 16 h de luz y 8 h de oscuridad y mantener una humedad relativa de aproximadamente el 75%.
4. Presente una tarjeta de huevo del huésped a las avispas para que las parasiten (Figura 1-ii). Deje que las avispas depositen sus huevos en los huevos del huésped durante 6 h, después de lo cual retire rápidamente las avispas.
   NOTA: Evite prolongar excesivamente el período de parasitación, ya que esto puede conducir a un hacinamiento de la descendencia de T. denrolimi dentro de un huevo huésped, lo que resulta en un aumento de la mortalidad de la avispa de la descendencia^28,29.

2. Síntesis de dsRNA

1. Diseñar conjuntos de cebadores que contengan un promotor T7 para la síntesis de ARN bicatenario (dsRNA). Elija un segmento de 300-400 pb del gen objetivo (Ferhch) para la síntesis de dsRNA.
2. Adquirir conjuntos de cebadores sintetizados comercialmente para la producción de dsRNA para el gen objetivo y dsGFP para su uso como control negativo.
3. Extraer el contenido de ARN de 100 avispas T. denrolimi utilizando el kit de referencia siguiendo el protocolo del fabricante⁹. Comprobar la calidad del contenido de ARN; si el valor de OD260/OD280 oscila entre 1,8 y 2,0⁹.
4. Purifique el contenido de ARN con 2 μL de tampón 5x (1 U/50 μL), 1 μL de ADNasa (1 U/50 μL) y 6,5 μL de ARN (~100 ng/μL), 0,5 μL de_H2O a 42 °C durante 2 min.
5. Realice la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) para generar una plantilla de ADNc con 10 μL de ARN purificado (~100 ng/μL), 4 μL de tampón 5x (1 U/50 μL), 1 μL de mezcla de enzimas I (1 U/50 μL) y 4 μL de_H2O. Realice la RT-PCR con los siguientes ajustes: 37 °C durante 15 min, 85 °C durante 5 s. Almacenar el producto de ADNc a -4 °C hasta su uso.
6. Realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar las secuencias de dsRNA de acuerdo con la mezcla maestra de referencia (10 μL de Taq II [1 U/50 μL], 0,8 μL de cebador directo [0,4 μM], 0,8 μL de cebador inverso [0,4 μM], 0,8 μL de molde de ADN [40 ng/μL] y 7,6 μL de_H2O). Realice la PCR con los siguientes ajustes: 94 °C durante 2 min; 35 ciclos con 94 °C durante 30 s, 60 °C durante 30 s, 72 °C durante 30 s; 72 °C durante 2 min.
7. Evaluar la calidad de los productos de PCR mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2,0% ^5,9 y confirmar la secuencia diana mediante secuenciación Sanger.
8. Purifique el producto de PCR con el kit de extracción de gel según las pautas del fabricante ^9,23.
9. Utilice un sistema de ARNi para sintetizar dsRNA para el gen diana con 10 μL de tampón 2x (0,02 U/μL), 8 μL de molde de ADN (75 ng/μL) y 2 μL de mezcla de enzimas (1 U/50 μL) con los siguientes ajustes: 37 °C durante 30 min, 70 °C durante 10 min, y 25 °C durante 20 min. Eluir el dsRNA sintetizado con 30 μL de agua libre de nucleasas.
10. Evaluar la calidad del producto dsRNA visualizándolo en un gel de agarosa al 1,0% ^5,9. Diluir el dsRNA a 7.000 ng/μL. Comprobar la calidad del producto dsRNA; si el valor de OD260/OD280 oscila entre 1,8 y 2,0⁹. Almacenar el producto dsRNA a -20 °C hasta su uso.

3. Trasplante de pupas de T. denrolimi

1. Cultive los huevos del huésped parasitado durante aproximadamente 8 días a 25 ± 1 ° C, manteniendo un ciclo de 16 h de luz/8 h de oscuridad y una humedad relativa de ~ 75%. Los huevos del huésped parasitado se ennegrecerán después de 5 días³⁰ (Figura 1-iv, v).
2. Transfiera la tarjeta del huevo huésped a un microscopio de disección. Emplee un par de agujas de tungsteno (Figura 1-vi) para eliminar meticulosamente el corion de los huevos del huésped (Figura 1-vii) y recuperar la pupa del interior (Figura 1-viii)^5,17,18.
   NOTA: La punta de la aguja de disección debe ser inferior a 0,05 mm.
3. Prepare una placa limpia para el sustrato. Vierta 10-15 ml de una solución de agar de 15 g/L, dejando que se enfríe naturalmente (Figura 2-i).
   NOTA: Mezcle la solución de agar con 0,5 g de estreptomicina para inhibir el crecimiento de contaminantes in vitro.
4. Emplee un buril desinfectado para grabar varias ranuras que midan 0,2-0,3 mm de profundidad y 0,4-0,8 mm de ancho (Figura 2-ii).
5. Use un cepillo pequeño (Figura 2-iii) para trasplantar una pupa del huevo huésped diseccionado a una de las ranuras del sustrato de agar (Figura 2-iv).
6. Repita los pasos 3.4 y 3.5, trasplantando 100-300 pupas individualmente en los surcos uno por uno (Figura 2-v).

4. Microinyección de dsRNA en la pupa de T. denrolimi

1. Use un extractor de agujas de vidrio para extraer un capilar de vidrio (Figura 3-i, ii). Ajuste el calor a 280, la velocidad a 170, el retardo a 250 y el tirón a 30 en un extractor de agujas (Figura 3-iii). Prepare varias agujas de vidrio capilar para la microinyección (Figura 3-iv, v).
2. Biselar la punta de la aguja de vidrio con una placa abrasiva (Figura 3-vi).
   NOTA: Asegúrese de que la punta de la aguja de inyección permanezca afilada; de lo contrario, puede provocar la mortalidad de la pupa o impedir el flujo de reactivos a través de la aguja (Figura 3-vii).
3. Cargue aproximadamente 2 μL de la solución inyectable de dsRNA con 7.000 ng/μL en la aguja de inyección preparada utilizando una bomba de microinyección (Figura 3-vii).
4. Transfiera el sustrato de agar que contiene cientos de pupas a la plataforma de un microscopio compuesto (Figura 3-viii).
5. Inserte con cuidado la aguja de inyección en el abdomen de una pupa de T. denrolimi en un ángulo de ~30° con respecto al abdomen debajo de la lente (Figura 3-ix).
6. Inyecte gradualmente ~ 5 nL de la solución inyectable (paso 4.3) en la pupa de T. denrolimi lo más suavemente posible.
   NOTA: La pupa de T. denrolimi puede hincharse ligeramente a medida que se inyecta la solución de dsRNA. La inyección de una cantidad excesiva de solución en la pupa o el uso de agujas con aberturas demasiado grandes puede provocar la muerte prematura de la pupa. Cambie las agujas cuando se obstruyan después de inyectar varias o decenas de pupas.
7. Repita los pasos 4.5 y 4.6, inyectando dsRNA en 600 pupas una por una.
   NOTA: Para un análisis confiable de RT-qPCR, el contenido de ARN debe aislarse de al menos 100 pupas. Inyectar al menos 600 pupas para tres réplicas en el tratamiento con dsRNA y tres réplicas en el control negativo de dsGFP ⁹.

5. Incubación de pupas de T. denrolimi

1. Transfiera el sustrato que contiene las pupas inyectadas a una incubadora a 25 ± 1 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 16 h/8 h y ~75% HR.
2. Incubar aproximadamente 700 pupas de T. denrolimi por tratamiento durante 24 h o 48 h. Extraer el contenido de ARN de un grupo de 100 pupas por réplica⁹.
   NOTA: Retire las pupas encogidas (pupas muertas) de las muestras; de lo contrario, puede dar lugar a errores en la detección de la expresión génica.
3. Incubar ~50 pupas de T. denrolimi por tratamiento hasta que emerjan las avispas (Figura 3-x). Registre la tasa de emergencia y la tasa de deformidad.

6. Detección de la expresión génica diana

1. Diseñar el conjunto de cebadores para el gen diana y los genes de referencia para RT-qPCR utilizando una herramienta de diseño.
   NOTA: Asegúrese de que las secuencias de los cebadores RT-qPCR no se superpongan con la región objetivo del dsRNA.
2. Emplear el gen forkhead box O (FoxO) como gen de referencia en el análisis de RT-qPCR; los cebadores de FoxO han sido reportados previamente⁹.
3. Obtener juegos de cebadores sintetizados comercialmente. Realice RT-qPCR con 10 μL de Taq II (1 U/50 μL), 0,8 μL de cebador directo (0,4 μM), 0,8 μL de cebador inverso (0,4 μM), 0,8 μL de molde (10 ng/μL) y 7,6 μL de_H2O. Realice RT-qPCR con los siguientes ajustes: 95 °C durante 30 s; 35 ciclos con 95 °C durante 5 s, 57 °C durante 30 s, 72 °C durante 30; 95 °C durante 10 s; 60 °C durante 5 s y 95 °C durante 5 s.
4. Calcular el valor de expresión del gen diana mediante el método ^{2-ΔΔCt 9,25}.
5. Emplear la prueba de Kruskal-Wallis para analizar la expresión del gen diana bajo la influencia de diferentes tratamientos (dsFerhch, dsGFP, no inyección).
   NOTA: Evite el uso de pruebas paramétricas (p. ej., prueba t) para comparaciones post-hoc, ya que la heterocedasticidad y la no normalidad de los datos pueden llevar a conclusiones erróneas²⁵.

Resultados

La tasa de emergencia de pupas de T. denrolimi inyectadas con dsFerhch fue significativamente menor que la de las inyectadas con dsGFP o las que no lo recibieron (Tabla 1). Entre las avispas emergidas, el 51,85% de las avispas T. denrolimi sometidas a dsFerhch desarrollaron pequeñas alas deformadas. Las avispas deformadas no se observaron en las avispas inyectadas con dsGFP o sin ninguna inyección (Tabla 1). Además, los abdómenes ...

Discusión

Las avispas Trichogramma son reconocidas como agentes de control biológico eficaces, dirigidos específicamente a una variedad de plagas de lepidópteros en la agricultura y la silvicultura¹. Estas diminutas avispas pasan por sus etapas inmaduras dentro del huevo huésped, una característica que presenta desafíos en la realización de experimentos de ARNi ^5,18. Este estudio ofrece una guía visual completa para la realización ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x ES Taq MasterMix (Dye)	Cowin Biotech, China	CW0690H	To amplify the dsRNA sequences
20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6)	Sangon Biotech, China	B540627-0500	To dilute dsRNA
Agar strip	Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China	n/a	To make culture medium
Ampicillin sodium	Sangon Biotech, China	A610028	To make culture medium
Bioer Constant temperature metal bath	BIOER, China	MB-102	To synthesis dsRNA
Borosilicate glass capillary	WPI, USA	1B100-4	To pull capillary glass needle
Clean bench	Airtech, China	SW-CJ-1FD	To extract RNA
Double distilled water	Sangon Biotech, China	A500197-0500	To dilute cDNA
Environmental Testing chamber	Panasonic, Japan	MLR-352H-PC	To culture T. denrolimi
Eppendorf Centrifuge	Eppendrof, Germany	5418R	To store RNA content
Eppendorf FemtoJet 4i	Eppendrof, Germany	FemtoJet 4i	To inject T. denrolimi
Eppendorf Refrigerated Centrifuge	Eppendrof, Germany	5810R	Centrifuge
Ethanol solution (75%, RNase-free)	Aladdin, China	M052131-500ml	To extract RNA
Gel Extraction Kit	Omega, USA	D25000-02	To extract cDNA
GUM Arabic	Solarbio, China	CG5991-500g	To make egg card
Isopropyl alchohol	Aladdin, China	80109218	To extract RNA
Laser-Based Micropipette Puller	SUTTER, USA	P-2000	To pull capillary glass needle
Microloader	Eppendrof, Germany	20 µL	To load dsRNA
Multi-sample tissue grinder	LICHEN, China	LC-TG-24	To grind T. denrolimi
Needle Grinder	SUTTER, USA	BV-10-E	To grind capillary glass needle
Nuclease-Free Water	Sangon Biotech, China		To dilute RNA
OLYMPUS Microscope	OLYMPUS, Japan	XZX16	To observe T. denrolimi
PCR machine	Bio-rad, USA	S-1000	For DNA amplification
PowerPac Basic	Bio-rad, USA	PowerPacTM Basic	To detect the quality of dsRNA
Primer of dsGFP (Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA
Primer of dsGFP (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG
Primer of Ferhch for qPCR (Forward)			TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT
Primer of Ferhch for qPCR (Reverse)			CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT
Primer of Ferhch for RNAi (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC
Primer of Ferhch for RNAi(Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG
Primer of FoxO for qPCR (Forward)			CTACGCCGATCTCATAACGC
Primer of FoxO for qPCR (Reverse)			TGCTGTCGCCCTTGTCCT
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)	TaKaRa, Japan	RR047A
Quantitative Real-time PCR	Bio-rad, USA	CFX 96 Touch	To perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Tool			https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/
T7 RiBoMAX Express RNAi System	Promega, USA	P1700	To synthesis dsRNA  in vitro
TB Green Premix Ex TaqTM (Til RnaseH Plus)	TaKaRa, Japan	RR820A	To perform RT-qPCR
Trichloromethane	KESHI, China	GB/T682-2002	To extract RNA
TRIzol Reagent	Ambion, USA	15596018	To extract total RNA content from samples
Ultra-low Temperature Freezer	Thermo, USA	Forma 911