Interferenza dell'RNA nel parassitoide dell'uovo, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Riepilogo

La manipolazione dell'interferenza dell'RNA (RNAi) rappresenta una sfida formidabile in molte specie di parassitoidi di dimensioni ridotte, come le vespe Trichogramma . Questo studio ha delineato un metodo RNAi efficiente in Trichogramma denrolimi. La presente metodologia fornisce un modello robusto per lo studio della regolazione genica nelle vespe Trichogramma .

Abstract

I parassitoidi dell'uovo, Trichogramma spp, sono riconosciuti come efficaci agenti di controllo biologico contro vari parassiti lepidotteri in agricoltura e foreste. Gli stadi immaturi della prole di Trichogramma si sviluppano all'interno dell'uovo ospite, mostrando una notevole piccolezza (circa 0,5 mm di lunghezza da adulto). La metodologia dell'interferenza dell'RNA (RNAi) è emersa come uno strumento cruciale per chiarire le funzioni dei geni in numerosi organismi. Tuttavia, la manipolazione dell'RNAi in alcune piccole specie di parassitoidi, come Trichogramma, ha generalmente posto sfide significative. In questo studio, presentiamo un metodo RNAi efficiente in Trichogramma denrolimi. La procedura delineata comprende l'acquisizione e l'isolamento di singoli campioni di T. dendrolimi da uova ospiti, la progettazione e la sintesi di RNA a doppio filamento (dsRNA), il trapianto e la coltivazione in vitro di pupe di T. dendrolimi , la micro-iniezione di dsRNA e la successiva valutazione del knockdown del gene bersaglio attraverso l'analisi RT-qPCR. Questo studio fornisce una procedura completa e visivamente dettagliata per condurre esperimenti di RNAi in T. dendrolimi, consentendo così ai ricercatori di studiare la regolazione genica in questa specie. Inoltre, questa metodologia è adattabile per studi di RNAi o micro-iniezioni in altre specie di Trichogramma con piccoli aggiustamenti, rendendola un prezioso riferimento per condurre esperimenti di RNAi in altre specie endoparassitarie.

Introduzione

Trichogramma spp. è un gruppo di parassitoidi delle uova che sono stati ampiamente utilizzati come agenti di controllo biologico altamente efficienti contro un ampio spettro di parassiti lepidotteri negli ecosistemi agricoli e forestali di tutto il mondo 1,2,3,4. L'applicazione di Trichogramma allevato in massa fornisce un approccio ecologico per la gestione sostenibile dei parassiti ^5,6,7. La comprensione della biologia molecolare delle vespe Trichogramma fornisce preziose informazioni per migliorare l'efficienza dell'allevamento di massa e le prestazioni sul campo di questi agenti di controllo biologico ^8,9 studiando la metodologia di regolazione genica e l'editing del genoma¹⁰.

Dalla scoperta dell'interferenza genetica specifica mediata da RNA a doppio filamento (dsRNA) in Caenorhabditis elegans nel 1998, il metodo dell'interferenza dell'RNA (RNAi) si è evoluto in un kit di strumenti genetici vitali per esplorare i meccanismi di regolazione degli organismi sopprimendo l'espressione dei geni bersaglio¹¹. Gli esperimenti di RNAi sono diventati una metodologia standard ampiamente applicata per studiare la funzione genica in numerose specie di insetti^12,13. Ciononostante, la manipolazione dell'RNAi rappresenta una sfida formidabile in molte specie di parassitoidi, in particolare tra quelle appartenenti alla famiglia degli endoparassiti Chalcidoidea 14,15,16. Il metodo RNAi è stato documentato in almeno 13 specie di parassitoidi 14,15,16,17,18,19. Tra questi, l'approccio RNAi è stato condotto in modo completo nelle vespe di Nasonia ed è applicabile in tutte le fasi di sviluppo, inclusi embrioni, larve, pupe e adulti 14,15,16. È interessante notare che le vespe Nasonia sono ectoparassitoidi, con la loro prole che si sviluppa nello spazio interstiziale tra la pupa ospite e il pupario, consentendo la loro coltivazione in vitro e facendo tollerare loro alcuni trattamenti, come la microiniezione. A differenza delle vespe Nasonia, gli individui di Trichogramma subiscono l'intero sviluppo embrionale, larvale e pupale all'interno dell'uovo ospite. Lo strato allo stadio embrionale e larvale (che può ostacolare la permeabilità del dsRNA), la vulnerabilità ai danni e la difficoltà di sopravvivere in vitro presentano ostacoli formidabili 20,21,22. Inoltre, le dimensioni ridotte degli individui di Trichogramma, circa ~ 0,5 mm di lunghezza adulta o pupale, li rendono estremamente intricati da manipolare 20,21,22.

Nel presente studio, delineiamo una procedura completa per condurre esperimenti di interferenza dell'RNA (RNAi) in Trichogramma denrolimi Matsumura. Questa procedura comprende le seguenti procedure: (1) la progettazione e la sintesi di RNA a doppio filamento (dsRNA), (2) la microiniezione di pupe di T. denrolimi, (3) il trapianto e l'incubazione in vitro di queste pupe e (4) il rilevamento del knockdown del gene bersaglio attraverso l'analisi RT-qPCR. Il gene bersaglio selezionato per l'esperimento RNAi è l'omologia della catena pesante della ferritina (Ferhch). FerHCH, una proteina legante il ferro, contiene un centro ferroxidasico dotato di capacità antiossidanti, facilitando l'ossidazione di Fe²⁺ a Fe³⁺. Svolge un ruolo indispensabile nella crescita e nello sviluppo di vari organismi mantenendo l'equilibrio redox e l'omeostasi del ferro. La deplezione di FerHCH può provocare l'accumulo eccessivo di ferro, portando a danni irreversibili ai tessuti e spesso culminando in significative alterazioni fenotipiche, tra cui difetti di crescita, deformità e mortalità ^23,24. Questo studio offre una guida passo-passo per la conduzione dell'RNAi in T. denrolimi, che sarà preziosa per studiare le funzioni geniche nel più ampio contesto delle vespe Trichogramma.

Protocollo

NOTA: Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, strumenti, software e reagenti utilizzati in questo protocollo.

1. Raccolta e mantenimento della coltura degli insetti

1. Far aderire un gruppo di ~5.000 uova di Corcyra cephalonica (Stainton) su un cartoncino di 9 cm per 16 cm utilizzando una soluzione 1:5 (v/v) di gomma arabica in polvere e acqua^25,26.
   NOTA: Evitare di attaccare troppe uova ospiti alla scheda in quanto il sovraffollamento rende impraticabile le successive procedure di trasferimento e dissezione.
2. Per evitare la schiusa delle uova dell'ospite, sottoporre le schede uovo dell'ospite a 30 minuti di irradiazione ultravioletta (UV) (Figura 1-i). Successivamente, tagliare la carta con le uova inattivate in cartoncini di 1 cm di spessore e 8 cm di diametro, ciascuno contenente circa 300-500 uova (Figura 1-ii)25,26,27.
3. Introdurre una coorte di 80-120 vespe T. denrolimi in un tubo di vetro di 2 cm di diametro e 8 cm di lunghezza. Sigillare il tubo con del cotone.
   NOTA: Mantenere le vespe ad una temperatura di 25 ± 1 °C, con un ciclo luce/buio di 16 h di luce e 8 h di buio e mantenere un'umidità relativa di circa il 75%.
4. Presentare una scheda uovo ospite alle vespe per la parassitazione (Figura 1-ii). Lasciare che le vespe depositino le uova nelle uova ospiti per 6 ore, dopodiché rimuovere prontamente le vespe.
   NOTA: Evitare di prolungare eccessivamente il periodo di parassitizzazione in quanto ciò può portare al sovraffollamento della prole di T. denrolimi all'interno di un uovo ospite, con conseguente aumento della mortalità delle vespe della prole^28,29.

2. Sintesi di dsRNA

1. Progetta set di primer contenenti un promotore T7 per la sintesi di RNA a doppio filamento (dsRNA). Scegli un segmento di 300-400 bp dal gene bersaglio (Ferhch) per la sintesi di dsRNA.
2. Acquisire set di primer sintetizzati commercialmente per la produzione di dsRNA per il gene bersaglio e dsGFP da utilizzare come controllo negativo.
3. Estrarre il contenuto di RNA da 100 vespe T. denrolimi utilizzando il kit di riferimento seguendo il protocollo del produttore⁹. Controllare la qualità del contenuto di RNA; procedere se il valore di OD260/OD280 è compreso tra 1,8 e 2,0⁹.
4. Purificare il contenuto di RNA con 2 μL di tampone 5x (1 U/50 μL), 1 μL di DNAsi (1 U/50 μL) e 6,5 μL di RNA (~100 ng/μL), 0,5 μL di H₂O a 42 °C per 2 min.
5. Eseguire la reazione a catena della polimerasi con trascrittasi inversa (RT-PCR) per generare un modello di cDNA con 10 μL di RNA purificato (~100 ng/μL), 4 μL di tampone 5x (1 U/50 μL), 1 μL di miscela enzimatica I (1 U/50 μL) e 4 μL di H₂O. Eseguire la RT-PCR utilizzando le seguenti impostazioni: 37 °C per 15 min, 85 °C per 5 s. Conservare il prodotto cDNA a -4 °C fino all'uso.
6. Eseguire la reazione a catena della polimerasi (PCR) per amplificare le sequenze di dsRNA in conformità con la miscela principale di riferimento (10 μL di Taq II [1 U/50 μL], 0,8 μL di primer diretto [0,4 μM], 0,8 μL di primer inverso [0,4 μM], 0,8 μL di DNA stampo [40 ng/μL] e 7,6 μL di H₂O). Eseguire la PCR utilizzando le seguenti impostazioni: 94 °C per 2 min; 35 cicli con 94 °C per 30 s, 60 °C per 30 s, 72 °C per 30; 72 °C per 2 min.
7. Valutare la qualità dei prodotti PCR mediante elettroforesi su un gel di agarosio al 2,0% ^5,9 e confermare la sequenza target attraverso il sequenziamento Sanger.
8. Purificare il prodotto PCR utilizzando il kit di estrazione del gel secondo le linee guida del produttore ^9,23.
9. Utilizzare un sistema RNAi per sintetizzare dsRNA per il gene bersaglio con 10 μL di tampone 2x (0,02 U/μL), 8 μL di stampo di DNA (75 ng/μL) e 2 μL di miscela enzimatica (1 U/50 μL) con le seguenti impostazioni: 37 °C per 30 min, 70 °C per 10 min e 25 °C per 20 min. Eluire il dsRNA sintetizzato con 30 μL di acqua priva di nucleasi.
10. Valutare la qualità del prodotto dsRNA visualizzandolo su un gel di agarosio all'1,0% ^5,9. Diluire il dsRNA a 7.000 ng/μL. Controllare la qualità del prodotto dsRNA; procedere se il valore di OD260/OD280 è compreso tra 1,8 e 2,0⁹. Conservare il prodotto dsRNA a -20 °C fino al momento dell'uso.

3. Trapianto di pupe di T. denrolimi

1. Coltivare le uova ospiti parassitate per circa 8 giorni a 25 ± 1°C, mantenendo un ciclo di 16 ore di luce/8 ore di buio e un'umidità relativa di ~75%. Le uova dell'ospite parassitato si anneriranno dopo 5 giorni³⁰ (Figura 1-iv,v).
2. Trasferire la scheda dell'uovo ospite su un microscopio da dissezione. Utilizzare un paio di aghi di tungsteno (Figura 1-vi) per rimuovere meticolosamente il corion dalle uova ospiti (Figura 1-vii) e recuperare la pupa dall'interno (Figura 1-viii)^5,17,18.
   NOTA: La punta dell'ago da dissezione deve essere inferiore a 0,05 mm.
3. Preparare una piastra pulita per il substrato. Versare 10-15 mL di una soluzione di agar da 15 g/L, lasciandola raffreddare naturalmente (Figura 2-i).
   NOTA: Miscelare la soluzione di agar con 0,5 g di streptomicina per inibire la crescita di contaminanti in vitro.
4. Utilizzare un bulino disinfettato per incidere diverse scanalature che misurano 0,2-0,3 mm di profondità e 0,4-0,8 mm di larghezza (Figura 2-ii).
5. Utilizzare uno spazzolino (Figura 2-iii) per trapiantare una pupa dall'uovo ospite sezionato in una delle scanalature del substrato di agar (Figura 2-iv).
6. Ripetere i passaggi 3.4 e 3.5, trapiantando 100-300 pupe singolarmente nei solchi una per una (Figura 2-v).

4. Micro-iniezione di dsRNA nella pupa di T. denrolimi

1. Utilizzare un estrattore di aghi di vetro per tirare un capillare di vetro (Figura 3-i,ii). Impostare il calore su 280, la velocità su 170, il ritardo su 250 e il tiro su 30 su un estrattore ad ago (Figura 3-iii). Preparare più aghi di vetro capillare per la microiniezione (Figura 3-iv,v).
2. Smussare la punta dell'ago di vetro utilizzando una piastra abrasiva (Figura 3-vi).
   NOTA: Assicurarsi che la punta dell'ago per iniezione rimanga affilata; in caso contrario, può causare la mortalità della pupa o impedire il flusso del reagente attraverso l'ago (Figura 3-vii).
3. Caricare circa 2 μL della soluzione iniettabile di dsRNA con 7.000 ng/μL nell'ago di iniezione preparato utilizzando una pompa per microiniezione (Figura 3-vii).
4. Trasferire il substrato di agar contenente centinaia di pupe sulla piattaforma di un microscopio composto (Figura 3-viii).
5. Inserire con cautela l'ago per iniezione nell'addome di una pupa di T. denrolimi con un angolo di ~30° rispetto all'addome sotto la lente (Figura 3-ix).
6. Iniettare gradualmente ~5 nL della soluzione iniettabile (fase 4.3) nella pupa di T. denrolimi il più delicatamente possibile.
   NOTA: La pupa di T. denrolimi può gonfiarsi leggermente quando viene iniettata la soluzione di dsRNA. L'iniezione di una quantità eccessiva di soluzione nella pupa o l'uso di aghi con aperture troppo grandi può provocare la morte prematura della pupa. Cambiare gli aghi quando si ostruiscono dopo aver iniettato da diverse a decine di pupe.
7. Ripetere i passaggi 4.5 e 4.6, iniettando dsRNA in 600 pupe una per una.
   NOTA: Per un'analisi RT-qPCR affidabile, il contenuto di RNA deve essere isolato da almeno 100 pupe. Iniettare almeno 600 pupe per tre repliche nel trattamento con dsRNA e tre repliche nel controllo negativo con dsGFP ⁹.

5. Incubazione delle pupe di T. denrolimi

1. Trasferire il substrato contenente le pupe iniettate in un'incubatrice a 25 ± 1 °C con un ciclo luce/buio di 16 ore/8 ore e ~75% di umidità relativa.
2. Incubare circa 700 pupe di T. denrolimi per trattamento per 24 o 48 ore. Estrarre il contenuto di RNA da un gruppo di 100 pupe per replicato⁹.
   NOTA: Rimuovere le pupe rimpicciolite (pupe morte) dai campioni; in caso contrario, potrebbero verificarsi errori nel rilevamento dell'espressione genica.
3. Incubare ~50 pupe di T. denrolimi per trattamento fino a quando le vespe non emergono (Figura 3-x). Registrare il tasso di emergenza e il tasso di deformità.

6. Rilevamento dell'espressione genica mirata

1. Progettare il set di primer per il gene bersaglio e i geni di riferimento per la RT-qPCR utilizzando uno strumento di progettazione.
   NOTA: Assicurarsi che le sequenze dei primer RT-qPCR non si sovrappongano alla regione bersaglio del dsRNA.
2. Utilizzare il gene forkhead box O (FoxO) come gene di riferimento nell'analisi RT-qPCR; i primer di FoxO sono stati segnalati in precedenza⁹.
3. Ottenere set di primer sintetizzati commercialmente. Eseguire la RT-qPCR con 10 μL di Taq II (1 U/50 μL), 0,8 μL di primer diretto (0,4 μM), 0,8 μL di primer inverso (0,4 μM), 0,8 μL di stampo (10 ng/μL) e 7,6 μL di H₂O. Eseguire la RT-qPCR utilizzando le seguenti impostazioni: 95 °C per 30 s; 35 cicli con 95 °C per 5 s, 57 °C per 30 s, 72 °C per 30; 95 °C per 10 s; 60 °C per 5 sec. e 95 °C per 5 s.
4. Calcolare il valore di espressione del gene bersaglio utilizzando il metodo ^{2-ΔΔCt 9,25}.
5. Utilizzare il test di Kruskal-Wallis per analizzare l'espressione del gene bersaglio sotto l'influenza di diversi trattamenti (dsFerhch, dsGFP, non iniettabile).
   NOTA: Evitare l'uso di test parametrici (ad esempio, t-test) per confronti post-hoc poiché l'eteroschedasticità e la non normalità dei dati possono portare a conclusioni errate²⁵.

Risultati

Il tasso di emergenza delle pupe di T. denrolimi iniettate con dsFerhch è stato significativamente inferiore a quello di quelle iniettate con dsGFP o di quelle senza iniezione (Tabella 1). Tra le vespe emerse, il 51,85% delle vespe T. denrolimi sottoposte a dsFerhch ha sviluppato piccole ali deformate. Le vespe deformi non sono state osservate nelle vespe iniettate con dsGFP o senza alcuna iniezione (Tabella 1). Inoltre, gli addomi d...

Discussione

Le vespe Trichogramma sono riconosciute come efficaci agenti di controllo biologico, mirati specificamente a una serie di parassiti lepidotteri in agricoltura e silvicoltura¹. Queste minuscole vespe subiscono i loro stadi immaturi all'interno dell'uovo ospite, una caratteristica che presenta sfide nella conduzione di esperimenti RNAi ^5,18. Questo studio offre una guida visiva completa per la conduzione di esperimenti di RNAi in

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x ES Taq MasterMix (Dye)	Cowin Biotech, China	CW0690H	To amplify the dsRNA sequences
20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6)	Sangon Biotech, China	B540627-0500	To dilute dsRNA
Agar strip	Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China	n/a	To make culture medium
Ampicillin sodium	Sangon Biotech, China	A610028	To make culture medium
Bioer Constant temperature metal bath	BIOER, China	MB-102	To synthesis dsRNA
Borosilicate glass capillary	WPI, USA	1B100-4	To pull capillary glass needle
Clean bench	Airtech, China	SW-CJ-1FD	To extract RNA
Double distilled water	Sangon Biotech, China	A500197-0500	To dilute cDNA
Environmental Testing chamber	Panasonic, Japan	MLR-352H-PC	To culture T. denrolimi
Eppendorf Centrifuge	Eppendrof, Germany	5418R	To store RNA content
Eppendorf FemtoJet 4i	Eppendrof, Germany	FemtoJet 4i	To inject T. denrolimi
Eppendorf Refrigerated Centrifuge	Eppendrof, Germany	5810R	Centrifuge
Ethanol solution (75%, RNase-free)	Aladdin, China	M052131-500ml	To extract RNA
Gel Extraction Kit	Omega, USA	D25000-02	To extract cDNA
GUM Arabic	Solarbio, China	CG5991-500g	To make egg card
Isopropyl alchohol	Aladdin, China	80109218	To extract RNA
Laser-Based Micropipette Puller	SUTTER, USA	P-2000	To pull capillary glass needle
Microloader	Eppendrof, Germany	20 µL	To load dsRNA
Multi-sample tissue grinder	LICHEN, China	LC-TG-24	To grind T. denrolimi
Needle Grinder	SUTTER, USA	BV-10-E	To grind capillary glass needle
Nuclease-Free Water	Sangon Biotech, China		To dilute RNA
OLYMPUS Microscope	OLYMPUS, Japan	XZX16	To observe T. denrolimi
PCR machine	Bio-rad, USA	S-1000	For DNA amplification
PowerPac Basic	Bio-rad, USA	PowerPacTM Basic	To detect the quality of dsRNA
Primer of dsGFP (Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA
Primer of dsGFP (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG
Primer of Ferhch for qPCR (Forward)			TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT
Primer of Ferhch for qPCR (Reverse)			CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT
Primer of Ferhch for RNAi (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC
Primer of Ferhch for RNAi(Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG
Primer of FoxO for qPCR (Forward)			CTACGCCGATCTCATAACGC
Primer of FoxO for qPCR (Reverse)			TGCTGTCGCCCTTGTCCT
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)	TaKaRa, Japan	RR047A
Quantitative Real-time PCR	Bio-rad, USA	CFX 96 Touch	To perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Tool			https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/
T7 RiBoMAX Express RNAi System	Promega, USA	P1700	To synthesis dsRNA  in vitro
TB Green Premix Ex TaqTM (Til RnaseH Plus)	TaKaRa, Japan	RR820A	To perform RT-qPCR
Trichloromethane	KESHI, China	GB/T682-2002	To extract RNA
TRIzol Reagent	Ambion, USA	15596018	To extract total RNA content from samples
Ultra-low Temperature Freezer	Thermo, USA	Forma 911