卵に寄生する Trichogramma dendrolimi Matsumura におけるRNA干渉

要約

RNA干渉(RNAi)の操作は、 トリコグラマ スズメバチなど、サイズが小さい多くの寄生生物種において手ごわい課題となっています。この研究は、 Trichogramma denrolimiにおける効率的なRNAi法を明らかにしました。本手法は、 トリコグラマ バチの遺伝子制御を調査するための堅牢なモデルを提供します。

要約

卵寄生虫であるTrichogramma sppは、農業や森林におけるさまざまな鱗翅目の害虫に対する効率的な生物学的防除剤として認識されています。トリコグラマの子孫の未熟期は宿主卵内で発生し、顕著な小ささ(成体長約0.5mm)を示します。RNA干渉(RNAi)法は、多くの生物の遺伝子機能を解明するための重要なツールとして浮上しています。しかし、トリコグラムマなどの特定の小さな寄生生物種におけるRNAiの操作は、一般的に大きな課題を提起してきました。本研究では、Trichogramma denrolimiにおける効率的なRNAi法について紹介する。概説されている手順には、宿主卵からの個々のT.dendrolimi標本の取得と分離、二本鎖RNA(dsRNA)の設計と合成、T. dendrolimiの蛹のin vitro移植と培養、dsRNAのマイクロインジェクション、およびその後のRT-qPCR分析による標的遺伝子ノックダウンの評価が含まれます。この研究は、T. dendrolimiのRNAi実験を実施するための包括的で視覚的に詳細な手順を提供し、それによって研究者がこの種の遺伝子制御を調べることを可能にします。さらに、この方法論は、微調整を行うことで、他のトリコグラマ種におけるRNAi研究やマイクロインジェクションに適応可能であり、他の内部寄生種におけるRNAi実験を実施するための貴重な参考資料となります。

概要

Trichogramma spp.は、世界中の農業および森林生態系において、広範囲の鱗翅目害虫に対する高効率の生物学的防除剤として広く利用されている卵寄生虫のグループです^1,2,3,4。大量飼育されたTrichogrammaの適用は、害虫^5,6,7の持続可能な管理のための環境に優しいアプローチを提供します。トリコグラマバチの分子生物学を理解することは、遺伝子制御とゲノム編集の方法論を調査することにより、これらの生物学的防^除剤の大量飼育効率と圃場性能を向上させるための貴重な洞察を提供します^8,910。

1998年に線虫類における二本鎖RNA(dsRNA)を介した特異的遺伝的干渉が発見されて以来、RNA干渉(....

プロトコル

注:このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、ソフトウェア、および試薬に関する詳細については、 材料表 を参照してください。

1. 昆虫培養物の収集と維持

1. アラビアガム粉末と水の1:5(v / v)溶液を使用して、9 cm x 16 cmのカードにCorcyra cephalonica(Stainton)の~5,000個の卵のグループを付着させます^25,26。
   注:過密状態になると、その後の移植および解剖手順が実用的ではなくなるため、カードに宿主卵をあまり多く付着させないでください。
2. 宿主卵の孵化を防ぐため、宿主卵カードに30分間紫外線(UV)を照射する(図1-i)。続いて、不活化卵の入った紙を厚さ1cm、直径8cmの卵カードに切り、それぞれ約300〜500個の卵を入れます(図1-ii)25,26,27。....

ディスカッション

トリコグラマバチは、効果的な生物学的防除剤として認識されており、特に農業および林業におけるさまざまな鱗翅目害虫を標的としています¹。これらの小さなスズメバチは、宿主の卵の中で未熟な段階を経るため、RNAi実験を行う上で課題となる特徴があります^5,18。この研究は、T. denrolimiのRNAi実験を実施するため?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x ES Taq MasterMix (Dye)	Cowin Biotech, China	CW0690H	To amplify the dsRNA sequences
20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6)	Sangon Biotech, China	B540627-0500	To dilute dsRNA
Agar strip	Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China	n/a	To make culture medium
Ampicillin sodium	Sangon Biotech, China	A610028	To make culture medium
Bioer Constant temperature metal bath	BIOER, China	MB-102	To synthesis dsRNA
Borosilicate glass capillary	WPI, USA	1B100-4	To pull capillary glass needle
Clean bench	Airtech, China	SW-CJ-1FD	To extract RNA
Double distilled water	Sangon Biotech, China	A500197-0500	To dilute cDNA
Environmental Testing chamber	Panasonic, Japan	MLR-352H-PC	To culture T. denrolimi
Eppendorf Centrifuge	Eppendrof, Germany	5418R	To store RNA content
Eppendorf FemtoJet 4i	Eppendrof, Germany	FemtoJet 4i	To inject T. denrolimi
Eppendorf Refrigerated Centrifuge	Eppendrof, Germany	5810R	Centrifuge
Ethanol solution (75%, RNase-free)	Aladdin, China	M052131-500ml	To extract RNA
Gel Extraction Kit	Omega, USA	D25000-02	To extract cDNA
GUM Arabic	Solarbio, China	CG5991-500g	To make egg card
Isopropyl alchohol	Aladdin, China	80109218	To extract RNA
Laser-Based Micropipette Puller	SUTTER, USA	P-2000	To pull capillary glass needle
Microloader	Eppendrof, Germany	20 µL	To load dsRNA
Multi-sample tissue grinder	LICHEN, China	LC-TG-24	To grind T. denrolimi
Needle Grinder	SUTTER, USA	BV-10-E	To grind capillary glass needle
Nuclease-Free Water	Sangon Biotech, China		To dilute RNA
OLYMPUS Microscope	OLYMPUS, Japan	XZX16	To observe T. denrolimi
PCR machine	Bio-rad, USA	S-1000	For DNA amplification
PowerPac Basic	Bio-rad, USA	PowerPacTM Basic	To detect the quality of dsRNA
Primer of dsGFP (Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA
Primer of dsGFP (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG
Primer of Ferhch for qPCR (Forward)			TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT
Primer of Ferhch for qPCR (Reverse)			CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT
Primer of Ferhch for RNAi (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC
Primer of Ferhch for RNAi(Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG
Primer of FoxO for qPCR (Forward)			CTACGCCGATCTCATAACGC
Primer of FoxO for qPCR (Reverse)			TGCTGTCGCCCTTGTCCT
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)	TaKaRa, Japan	RR047A
Quantitative Real-time PCR	Bio-rad, USA	CFX 96 Touch	To perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Tool			https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/
T7 RiBoMAX Express RNAi System	Promega, USA	P1700	To synthesis dsRNA  in vitro
TB Green Premix Ex TaqTM (Til RnaseH Plus)	TaKaRa, Japan	RR820A	To perform RT-qPCR
Trichloromethane	KESHI, China	GB/T682-2002	To extract RNA
TRIzol Reagent	Ambion, USA	15596018	To extract total RNA content from samples
Ultra-low Temperature Freezer	Thermo, USA	Forma 911