卵に寄生する Trichogramma dendrolimi Matsumura におけるRNA干渉

要約

RNA干渉(RNAi)の操作は、 トリコグラマ スズメバチなど、サイズが小さい多くの寄生生物種において手ごわい課題となっています。この研究は、 Trichogramma denrolimiにおける効率的なRNAi法を明らかにしました。本手法は、 トリコグラマ バチの遺伝子制御を調査するための堅牢なモデルを提供します。

要約

卵寄生虫であるTrichogramma sppは、農業や森林におけるさまざまな鱗翅目の害虫に対する効率的な生物学的防除剤として認識されています。トリコグラマの子孫の未熟期は宿主卵内で発生し、顕著な小ささ(成体長約0.5mm)を示します。RNA干渉(RNAi)法は、多くの生物の遺伝子機能を解明するための重要なツールとして浮上しています。しかし、トリコグラムマなどの特定の小さな寄生生物種におけるRNAiの操作は、一般的に大きな課題を提起してきました。本研究では、Trichogramma denrolimiにおける効率的なRNAi法について紹介する。概説されている手順には、宿主卵からの個々のT.dendrolimi標本の取得と分離、二本鎖RNA(dsRNA)の設計と合成、T. dendrolimiの蛹のin vitro移植と培養、dsRNAのマイクロインジェクション、およびその後のRT-qPCR分析による標的遺伝子ノックダウンの評価が含まれます。この研究は、T. dendrolimiのRNAi実験を実施するための包括的で視覚的に詳細な手順を提供し、それによって研究者がこの種の遺伝子制御を調べることを可能にします。さらに、この方法論は、微調整を行うことで、他のトリコグラマ種におけるRNAi研究やマイクロインジェクションに適応可能であり、他の内部寄生種におけるRNAi実験を実施するための貴重な参考資料となります。

概要

Trichogramma spp.は、世界中の農業および森林生態系において、広範囲の鱗翅目害虫に対する高効率の生物学的防除剤として広く利用されている卵寄生虫のグループです^1,2,3,4。大量飼育されたTrichogrammaの適用は、害虫^5,6,7の持続可能な管理のための環境に優しいアプローチを提供します。トリコグラマバチの分子生物学を理解することは、遺伝子制御とゲノム編集の方法論を調査することにより、これらの生物学的防^除剤の大量飼育効率と圃場性能を向上させるための貴重な洞察を提供します^8,910。

1998年に線虫類における二本鎖RNA(dsRNA)を介した特異的遺伝的干渉が発見されて以来、RNA干渉(RNAi)法は、標的遺伝子の発現を抑制することにより、生物の調節メカニズムを探求するための重要な遺伝的ツールキットに進化しました¹¹。RNAi実験は、多くの昆虫種の遺伝子機能を研究するために広く適用されている標準的な方法論となっています^12,13。それにもかかわらず、RNAiの操作は、多くの寄生生物種、特に内部寄生性Chalcidoidea科に属する種において手ごわい課題を提示します14,15,16。RNAi法は、少なくとも13の寄生生物種^{(14、15、16、17、18、19})で文書化されています。このうち、RNAiアプローチはナソニアスズメバチで包括的に行われており、胚、幼虫、蛹、成虫を含む発生段階全体に適用できます^14,15,16。注目すべきは、ナソニアスズメバチは外部寄生虫であり、その子孫は宿主の蛹と蛹の間の間質空間で発達するため、試験管内での培養が可能になり、マイクロ注射などの特定の治療に耐えられるようになることです。ナソニアスズメバチとは異なり、トリコグラマの個体は、胚、幼虫、および蛹の全体の発生を宿主の卵の中で受けます。胚および幼虫期の層(dsRNAの透過性を妨げる可能性がある)、損傷に対する脆弱性、およびin vitroでの生存の難しさは、手ごわい障害を提示します20,21,22。さらに、Trichogramma個体は、成体または蛹体長が約~0.5mmと小柄なため、^20,21,22を操作するのは非常に複雑です。

本研究では、Trichogramma denrolimi MatsumuraにおけるRNA干渉(RNAi)実験を実施するための包括的な手順を概説する。この手順には、(1)二本鎖RNA(dsRNA)の設計と合成、(2)T. denrolimiの蛹のマイクロインジェクション、(3)これらの蛹の移植とin vitroインキュベーション、(4)RT-qPCR解析による標的遺伝子ノックダウンの検出が含まれます。RNAi実験で選択された標的遺伝子は、フェリチン重鎖相同性(Ferhch)です。鉄結合タンパク質であるFerHCHは、抗酸化能を備えたフェロキシダーゼ中心を含み、Fe²⁺からFe³⁺への酸化を促進します。酸化還元平衡と鉄の恒常性を維持することにより、さまざまな生物の成長と発達に不可欠な役割を果たしています。FerHCHの枯渇は、鉄の過剰蓄積をもたらし、不可逆的な組織損傷を引き起こし、多くの場合、成長欠陥、奇形、死亡率などの重大な表現型の変化で最高潮に達する可能性があります^23,24。この研究は、T. denrolimiでRNAiを実施するためのステップバイステップのガイドを提供し、Trichogramma wasphのより広い文脈の中で遺伝子機能を調査するために非常に貴重です。

プロトコル

注:このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、ソフトウェア、および試薬に関する詳細については、 材料表 を参照してください。

1. 昆虫培養物の収集と維持

1. アラビアガム粉末と水の1:5(v / v)溶液を使用して、9 cm x 16 cmのカードにCorcyra cephalonica(Stainton)の~5,000個の卵のグループを付着させます^25,26。
   注:過密状態になると、その後の移植および解剖手順が実用的ではなくなるため、カードに宿主卵をあまり多く付着させないでください。
2. 宿主卵の孵化を防ぐため、宿主卵カードに30分間紫外線(UV)を照射する(図1-i)。続いて、不活化卵の入った紙を厚さ1cm、直径8cmの卵カードに切り、それぞれ約300〜500個の卵を入れます(図1-ii)25,26,27。
3. 80〜120匹の T.denrolimi スズメバチのコホートを、直径2 cm、長さ8 cmのガラス管に入れます。チューブを綿で密封します。
   注意: スズメバチを25±〜1°Cの温度に維持し、明暗サイクルを16時間、暗さ8時間、相対湿度を約75%に維持します。
4. 寄生のためにスズメバチに宿主の卵カードを提示します(図1-ii)。スズメバチが宿主の卵に卵を6時間預けるのを許し、その後すぐにスズメバチを取り除きます。
   注:寄生期間を過度に延長すると、宿主の卵の中でT. denrolimiの子孫が過密になり、子孫のスズメバチの死亡率が増加する可能性があるため、避けてください^28,29。

2. dsRNAの合成

1. 二本鎖RNA(dsRNA)を合成するためのT7プロモーターを含むプライマーセットを設計します。dsRNA合成のために標的遺伝子(Ferhch)から300-400 bpセグメントを選択します。
2. ネガティブコントロールとして使用するために、標的遺伝子のdsRNAおよびdsGFP を産生するための市販のプライマーセットを入手します。
3. 100 T. denrolimi スズメバチから RNA 含有量を抽出し、メーカーのプロトコル⁹ に従って参照キットを使用します。RNA含有量の品質を確認します。OD260/OD280 の値が 1.8 から 2.0 の範囲であれば、続行します⁹.
4. 2 μL の 5x バッファー (1 U/50 μL)、1 μL の DNAse (1 U/50 μL)、6.5 μL の RNA (~100 ng/μL)、0.5 μL の H₂O で 42 °C で 2 分間、RNA 含有量を精製します。
5. 逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行い、精製RNA(~100 ng/μL)10 μL、5xバッファー4 μL(1 U/50 μL)、酵素ミックスI(1 μL/50 μL)1 μL、H₂O4 μLでcDNAテンプレートを作製します。 以下の設定を使用してRT-PCRを実施します。 37°Cで15分間、 85°Cで5秒。cDNA産物は、使用するまで-4°Cで保管してください。
6. ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い、参照したマスターミックス(10 μL の Taq II [1 U/50 μL]、0.8 μL のフォワードプライマー [0.4 μM]、0.8 μL のリバースプライマー [0.4 μM]、0.8 μL の DNA テンプレート [40 ng/μL]、および 7.6 μL の H₂O)に従って dsRNA 配列を増幅します。以下の設定を使用してPCRを実施します:94°Cで2分間。94°Cで30秒、60°Cで30秒、72°Cで30サイクル。72°Cで2分間
7. 2.0%アガロースゲル^5,9の電気泳動によってPCR産物の品質を評価し、サンガーシーケンシングによって標的配列を確認します。
8. メーカーのガイドライン^9,23に従って、ゲル抽出キットを使用してPCR産物を精製します。
9. RNAiシステムを利用して、10 μLの2xバッファー(0.02 U/μL)、8 μLのDNAテンプレート(75 ng/μL)、および2 μLの酵素ミックス(1 U/50 μL)で、37°Cで30分、70°Cで10分、25°Cで20分の設定で標的遺伝子のdsRNAを合成します。合成したdsRNAを30 μLのヌクレアーゼフリー水で溶出します。
10. dsRNA産物の品質を1.0%アガロースゲルで可視化して評価します^5,9。dsRNA を 7,000 ng/μL に希釈します。 dsRNA 産物の品質を確認します。OD260/OD280 の値が 1.8 から 2.0 の範囲であれば、続行します⁹.dsRNA産物は、使用するまで-20°Cで保管してください。

3. T. denrolimi 蛹の移植

1. 寄生した宿主卵を25±1°Cで約8日間培養し、16時間の明/8時間の暗サイクルと~75%の相対湿度を維持します。寄生された宿主の卵は、5日後に黒くなります³⁰ (図1-iv、v)。
2. 宿主の卵子カードを解剖顕微鏡に移します。一対のタングステン針(図1-vi)を使用して、宿主の卵から絨毛膜を細心の注意を払って除去し(図1-vii)、内部から蛹を回収します(図1-viii)^5,17,18。
   注意: 解剖針の先端は0.05mm未満である必要があります。
3. 基板用のクリーンプレートを準備します。15 g/Lの寒天溶液を10〜15 mL注ぎ、自然冷却します(図2-i)。
   注:寒天溶液を0.5gのストレプトマイシンと混合して、 in vitroで汚染物質の増殖を抑制します。
4. 深さ0.2〜0.3 mm、幅0.4〜0.8 mmの溝をエッチングするために、消毒された彫刻刀を使用します(図2-ii)。
5. 小さなブラシ(図2-iii)を使用して、解剖した宿主卵から寒天基質の溝の1つに蛹を移植します(図2-iv)。
6. 手順3.4と3.5を繰り返し、100〜300匹の蛹を1つずつ溝に移植します(図2-v)。

4. T. denrolimi pupaへのdsRNAのマイクロ注入

1. ガラスの針引き機を使用して、ガラスの毛細管を引っ張ります(図3-i、ii)。針引き機で、熱を 280 に、速度を 170 に、遅延を 250 に、プルを 30 に設定します(図 3-iii)。マイクロインジェクション用の複数のキャピラリーガラス針を準備します(図3-iv、v)。
2. 研磨板を使用してガラス針の先端を面取りします(図3-vi)。
   注意: 注射針の先端が鋭利なままであることを確認してください。そうしないと、蛹が死亡したり、針を通る試薬の流れが妨げられたりする可能性があります(図3-vii)。
3. 約2 μLのdsRNA注入液を7,000 ng/μLで、マイクロインジェクションポンプを使用して準備した注射針にロードします(図3-vii)。
4. 数百匹の蛹を含む寒天基質を複合顕微鏡のプラットフォームに移します(図3-viii)。
5. T . denrolimi の蛹の腹部に、レンズの下の腹部に対して~30°の角度で注射針を慎重に挿入します(図3-ix)。
6. ~5 nL の注入溶液を T. denrolimi の蛹にできるだけ穏やかに徐々に注入します (ステップ 4.3)。
   注: T. denrolimi pupa は、dsRNA 溶液を注入するとわずかに膨潤することがあります。蛹に過剰な量の溶液を注入したり、開口部が大きすぎる針を使用したりすると、蛹が早期に死亡する可能性があります。数個から数十個の蛹を注入した後、針が詰まった場合は針を交換してください。
7. 手順4.5と4.6を繰り返し、600匹の蛹にdsRNAを1匹ずつ注入します。
   注:信頼性の高いRT-qPCR分析のためには、少なくとも100匹の蛹からRNA含量を単離する必要があります。dsRNA 処理では 3 回、 dsGFP ネガティブコントロールでは 3 回繰り返し、少なくとも 600 匹の蛹を注入します⁹。

5. T. denrolimi 蛹の孵化

1. 注入した蛹を含む基質を、16時間/8時間の明暗サイクルと~75%RHで25±1°Cのインキュベーターに移します。
2. 処理ごとに約700 T.denrolimi の蛹を24時間または48時間インキュベートします。1回あたり100匹の蛹のグループからRNA含量を抽出します⁹.
   注:収縮した蛹(死んだ蛹)をサンプルから取り除きます。そうしないと、遺伝子発現の検出にエラーが生じる可能性があります。
3. スズメバチが羽化するまで、治療ごとに~50 T. denrolimi の蛹を孵化させます(図3-x)。出現率と変形率を記録します。

6. 標的遺伝子発現の検出

1. デザインツールを使用して、RT-qPCRの標的遺伝子および参照遺伝子のプライマーセットを設計します。
   注:RT-qPCRプライマーの配列がdsRNAの標的領域と重複していないことを確認してください。
2. RT-qPCR解析では、 フォークヘッドボックスO (FoxO)遺伝子を参照遺伝子として使用します。 FoxO のプライマー^{は以前に報告}されています9.
3. 市販のプライマーセットを入手します。10 μL の Taq II (1 U/50 μL)、0.8 μL のフォワードプライマー (0.4 μM)、0.8 μL のリバースプライマー (0.4 μM)、0.8 μL のテンプレート (10 ng/μL)、および 7.6 μL の H₂O で RT-qPCR を実行します。 以下の設定を使用して RT-qPCR を実行します。 95 °C で 30 秒間。95°Cで5秒、57°Cで30秒、72°Cで30サイクル。95°Cで10秒。60°Cで5秒、95°Cで5秒。
4. ^2-ΔΔCt法^9,25を用いて標的遺伝子の発現値を算出する。
5. Kruskal-Wallis検定を用いて、さまざまな治療(dsFerhch、 dsGFP、非注射)の影響下での標的遺伝子の発現を解析します。
   注:データの不均一性や非正規性が誤った結論につながる可能性があるため、事後比較にパラメトリック検定( t検定など)を使用することは避けてください²⁵。

結果

dsFerhchを注射したT. denrolimiの蛹の出現率は、dsGFPを注射した蛹や注射しなかった蛹よりも有意に低かった(表1)。羽化したスズメバチのうち、dsFerhchに曝露されたスズメバチの51.85%は変形した小さな翅を発達させた。変形したスズメバチは、dsGFPを注射したスズメバチまたは注射なしで観察されませんでした(表1)。さらに、dsFerh...

ディスカッション

トリコグラマバチは、効果的な生物学的防除剤として認識されており、特に農業および林業におけるさまざまな鱗翅目害虫を標的としています¹。これらの小さなスズメバチは、宿主の卵の中で未熟な段階を経るため、RNAi実験を行う上で課題となる特徴があります^5,18。この研究は、T. denrolimiのRNAi実験を実施するため?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x ES Taq MasterMix (Dye)	Cowin Biotech, China	CW0690H	To amplify the dsRNA sequences
20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6)	Sangon Biotech, China	B540627-0500	To dilute dsRNA
Agar strip	Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China	n/a	To make culture medium
Ampicillin sodium	Sangon Biotech, China	A610028	To make culture medium
Bioer Constant temperature metal bath	BIOER, China	MB-102	To synthesis dsRNA
Borosilicate glass capillary	WPI, USA	1B100-4	To pull capillary glass needle
Clean bench	Airtech, China	SW-CJ-1FD	To extract RNA
Double distilled water	Sangon Biotech, China	A500197-0500	To dilute cDNA
Environmental Testing chamber	Panasonic, Japan	MLR-352H-PC	To culture T. denrolimi
Eppendorf Centrifuge	Eppendrof, Germany	5418R	To store RNA content
Eppendorf FemtoJet 4i	Eppendrof, Germany	FemtoJet 4i	To inject T. denrolimi
Eppendorf Refrigerated Centrifuge	Eppendrof, Germany	5810R	Centrifuge
Ethanol solution (75%, RNase-free)	Aladdin, China	M052131-500ml	To extract RNA
Gel Extraction Kit	Omega, USA	D25000-02	To extract cDNA
GUM Arabic	Solarbio, China	CG5991-500g	To make egg card
Isopropyl alchohol	Aladdin, China	80109218	To extract RNA
Laser-Based Micropipette Puller	SUTTER, USA	P-2000	To pull capillary glass needle
Microloader	Eppendrof, Germany	20 µL	To load dsRNA
Multi-sample tissue grinder	LICHEN, China	LC-TG-24	To grind T. denrolimi
Needle Grinder	SUTTER, USA	BV-10-E	To grind capillary glass needle
Nuclease-Free Water	Sangon Biotech, China		To dilute RNA
OLYMPUS Microscope	OLYMPUS, Japan	XZX16	To observe T. denrolimi
PCR machine	Bio-rad, USA	S-1000	For DNA amplification
PowerPac Basic	Bio-rad, USA	PowerPacTM Basic	To detect the quality of dsRNA
Primer of dsGFP (Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA
Primer of dsGFP (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG
Primer of Ferhch for qPCR (Forward)			TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT
Primer of Ferhch for qPCR (Reverse)			CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT
Primer of Ferhch for RNAi (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC
Primer of Ferhch for RNAi(Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG
Primer of FoxO for qPCR (Forward)			CTACGCCGATCTCATAACGC
Primer of FoxO for qPCR (Reverse)			TGCTGTCGCCCTTGTCCT
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)	TaKaRa, Japan	RR047A
Quantitative Real-time PCR	Bio-rad, USA	CFX 96 Touch	To perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Tool			https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/
T7 RiBoMAX Express RNAi System	Promega, USA	P1700	To synthesis dsRNA  in vitro
TB Green Premix Ex TaqTM (Til RnaseH Plus)	TaKaRa, Japan	RR820A	To perform RT-qPCR
Trichloromethane	KESHI, China	GB/T682-2002	To extract RNA
TRIzol Reagent	Ambion, USA	15596018	To extract total RNA content from samples
Ultra-low Temperature Freezer	Thermo, USA	Forma 911