RNA-Interferenz im Ei-Parasitoiden, Trichogramma dendrolimi matsumura

Zusammenfassung

Die Manipulation der RNA-Interferenz (RNAi) stellt bei vielen parasitoiden Arten mit geringer Größe, wie z. B. Trichogramma-Wespen , eine gewaltige Herausforderung dar. Diese Studie beschrieb eine effiziente RNAi-Methode in Trichogramma denrolimi. Die vorliegende Methodik bietet ein robustes Modell für die Untersuchung der Genregulation bei Trichogramma-Wespen .

Zusammenfassung

Die Eiparasitoide, Trichogramma spp., sind als wirksame biologische Schädlingsbekämpfungsmittel gegen verschiedene Schmetterlingsschädlinge in Land- und Forstwirtschaft anerkannt. Die unreifen Stadien der Trichogramma-Nachkommen entwickeln sich innerhalb des Wirteis und weisen eine bemerkenswerte Winzigkeit auf (ca. 0,5 mm in der adulten Länge). Die RNA-Interferenz-Methode (RNAi) hat sich als entscheidendes Werkzeug zur Aufklärung von Genfunktionen in zahlreichen Organismen herausgestellt. Die Manipulation von RNAi in bestimmten kleinen parasitoiden Arten wie Trichogramma hat jedoch im Allgemeinen erhebliche Herausforderungen mit sich gebracht. In dieser Studie stellen wir eine effiziente RNAi-Methode in Trichogramma denrolimi vor. Das skizzierte Verfahren umfasst die Gewinnung und Isolierung einzelner T. dendrolimi-Proben aus Wirtseiern, das Design und die Synthese von doppelsträngiger RNA (dsRNA), die In-vitro-Transplantation und Kultivierung von T. dendrolimi-Puppen , die Mikroinjektion von dsRNA und die anschließende Beurteilung des Zielgen-Knockdowns durch RT-qPCR-Analyse. Diese Studie liefert ein umfassendes, visuell detailliertes Verfahren zur Durchführung von RNAi-Experimenten in T. dendrolimi und ermöglicht es den Forschern, die Genregulation in dieser Art zu untersuchen. Darüber hinaus ist diese Methodik mit geringfügigen Anpassungen für RNAi-Studien oder Mikroinjektionen in anderen Trichogramma-Arten anpassbar, was sie zu einer wertvollen Referenz für die Durchführung von RNAi-Experimenten an anderen endoparasitären Arten macht.

Einleitung

Trichogramma spp. sind eine Gruppe von Eiparasitoiden, die als hocheffiziente biologische Bekämpfungsmittel gegen ein breites Spektrum von Lepidoptera-Schädlingen in land- und forstwirtschaftlichen Ökosystemen weltweit eingesetzt wurden 1,2,3,4. Die Anwendung von Trichogramma aus Massenzucht bietet einen umweltfreundlichen Ansatz für die nachhaltige Bekämpfung von Schädlingen ^5,6,7. Das Verständnis der Molekularbiologie von Trichogramma-Wespen liefert wertvolle Einblicke in die Verbesserung der Massenaufzuchteffizienz und der Feldleistung dieser biologischen Bekämpfungsmittel ^8,9 durch die Untersuchung der Methodik der Genregulation und Genom-Editierung¹⁰.

Seit der Entdeckung der doppelsträngigen RNA (dsRNA)-vermittelten spezifischen genetischen Interferenz in Caenorhabditis elegans im Jahr 1998 hat sich die RNA-Interferenzmethode (RNAi) zu einem wichtigen genetischen Instrumentarium zur Erforschung der Regulationsmechanismen von Organismen entwickelt, indem sie die Expression von Zielgenen unterdrückt¹¹. RNAi-Experimente sind zu einer Standardmethode geworden, die häufig zur Untersuchung der Genfunktion bei zahlreichen Insektenarten eingesetzt wird^12,13. Nichtsdestotrotz stellt die Manipulation von RNAi bei vielen parasitoiden Arten eine gewaltige Herausforderung dar, insbesondere bei denen, die zur Familie der endoparasitären Chalkidoiden gehören 14,15,16. Die RNAi-Methode wurde bei mindestens 13 parasitoiden Spezies dokumentiert: 14,15,16,17,18,19. Unter diesen wurde der RNAi-Ansatz umfassend bei Nasonia-Wespen durchgeführt und ist in allen Entwicklungsstadien anwendbar, einschließlich Embryonen, Larven, Puppen und Erwachsenen 14,15,16. Es ist bemerkenswert, dass Nasonia-Wespen Ektoparasitoide sind, deren Nachkommen sich im Zwischenraum zwischen der Wirtspupa und dem Puparium entwickeln, was ihre Kultivierung in vitro ermöglicht und sie bestimmte Behandlungen wie Mikroinjektionen tolerieren lässt. Im Gegensatz zu Nasonia-Wespen durchlaufen Trichogramma-Individuen ihre gesamte Embryonal-, Larven- und Puppenentwicklung innerhalb des Wirteies. Die Schicht im Embryo- und Larvenstadium (die die dsRNA-Permeabilität beeinträchtigen kann), die Anfälligkeit für Schäden und die Schwierigkeit, in vitro zu überleben, stellen gewaltige Hindernisse dar 20,21,22. Darüber hinaus macht die geringe Größe von Trichogramma-Individuen, etwa ~0,5 mm in der Erwachsenen- oder Puppenlänge, sie äußerst kompliziert, um sie zu manipulieren 20,21,22.

In der vorliegenden Studie skizzieren wir ein umfassendes Verfahren zur Durchführung von RNA-Interferenz-Experimenten (RNAi) in Trichogramma denrolimi Matsumura. Dieses Verfahren umfasst die folgenden Verfahren: (1) das Design und die Synthese von doppelsträngiger RNA (dsRNA), (2) die Mikroinjektion von T. denrolimi-Puppen, (3) die Transplantation und Inkubation dieser Puppen und (4) den Nachweis des Zielgen-Knockdowns durch RT-qPCR-Analyse. Das für das RNAi-Experiment ausgewählte Zielgen ist die Ferritin-Schwerketten-Homologie (Ferhch). FerHCH, ein eisenbindendes Protein, enthält ein Ferroxidase-Zentrum, das mit antioxidativen Fähigkeiten ausgestattet ist und die Oxidation von Fe²⁺ zu Fe³⁺ erleichtert. Es spielt eine unverzichtbare Rolle beim Wachstum und der Entwicklung verschiedener Organismen, indem es das Redoxgleichgewicht und die Eisenhomöostase aufrechterhält. Die Erschöpfung von FerHCH kann zu einer Überakkumulation von Eisen führen, was zu irreversiblen Gewebeschäden führt und oft zu signifikanten phänotypischen Veränderungen führt, einschließlich Wachstumsdefekten, Deformitäten und Mortalität^23,24. Diese Studie bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Durchführung von RNAi in T. denrolimi, die für die Untersuchung der Genfunktionen im breiteren Kontext von Trichogramma-Wespen von unschätzbarem Wert sein wird.

Protokoll

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Instrumenten, Software und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Sammlung und Pflege von Insektenkulturen

1. Kleben Sie eine Gruppe von ~5.000 Eiern Corcyra cephalonica (Stainton) auf eine 9 cm x 16 cm große Karte mit einer 1:5 (v/v) Lösung aus Gummi arabicum-Pulver und Wasser^25,26.
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, zu viele Wirtseier an der Karte anzubringen, da die Überfüllung sie für nachfolgende Transfer- und Seziervorgänge unpraktisch macht.
2. Um das Schlüpfen von Wirtseiern zu verhindern, setzen Sie die Wirtseikarten 30 Minuten ultravioletter (UV) Bestrahlung aus (Abbildung 1-i). Schneiden Sie anschließend das Papier mit inaktivierten Eiern in Eierkarten mit einer Dicke von 1 cm und einem Durchmesser von 8 cm, die jeweils etwa 300-500 Eier enthalten (Abbildung 1-ii)25,26,27.
3. Führen Sie eine Kohorte von 80-120 T. denrolimi-Wespen in ein Glasröhrchen mit einem Durchmesser von 2 cm und einer Länge von 8 cm ein. Verschließen Sie den Schlauch mit Baumwolle.
   HINWEIS: Halten Sie die Wespen bei einer Temperatur von 25 ± 1 °C, mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit und halten Sie eine relative Luftfeuchtigkeit von ca. 75 % aufrecht.
4. Legen Sie den Wespen eine Wirtsei-Karte zur Parasitierung vor (Abbildung 1-ii). Lassen Sie die Wespen ihre Eier 6 Stunden lang in die Wirtseier legen, danach entfernen Sie die Wespen sofort.
   HINWEIS: Vermeiden Sie eine übermäßige Verlängerung der Parasitierungsperiode, da dies zu einer Überfüllung der Nachkommen von T. denrolimi in einem Wirtsei führen kann, was zu einer erhöhten Wespensterblichkeit der Nachkommen führen^{kann 28,29}.

2. Synthese von dsRNA

1. Design-Primer-Sets mit einem T7-Promotor für die Synthese von doppelsträngiger RNA (dsRNA). Wählen Sie ein 300-400 bp-Segment aus dem Zielgen (Ferhch) für die dsRNA-Synthese.
2. Beschaffung kommerziell synthetisierter Primer-Sets für die Herstellung von dsRNA für das Zielgen undds-GFP zur Verwendung als Negativkontrolle.
3. Extrahieren Sie den RNA-Gehalt von 100 T. denrolimi-Wespen mit dem referenzierten Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers⁹. Überprüfen Sie die Qualität des RNA-Gehalts; Fahren Sie fort, wenn der Wert von OD260/OD280 zwischen 1,8 und 2,0⁹ liegt.
4. Reinigen Sie den RNA-Gehalt mit 2 μl 5x-Puffer (1 U/50 μl), 1 μl DNAse (1 U/50 μl) und 6,5 μl RNA (~100 ng/μl), 0,5 μl H₂O bei 42 °C für 2 min.
5. Führen Sie eine Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) durch, um ein cDNA-Template mit 10 μl gereinigter RNA (~100 ng/μl), 4 μl 5x-Puffer (1 U/50 μl), 1 μl Enzymmix I (1 U/50 μl) und 4 μl H₂O zu erzeugen. Führen Sie die RT-PCR mit den folgenden Einstellungen durch: 37 °C für 15 min, 85 °C für 5 s. Lagern Sie das cDNA-Produkt bis zur Verwendung bei -4 °C.
6. Führen Sie eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durch, um die dsRNA-Sequenzen gemäß dem referenzierten Mastermix zu amplifizieren (10 μl Taq II [1 U/50 μl], 0,8 μl Vorwärtsprimer [0,4 μM], 0,8 μl Reverse-Primer [0,4 μM], 0,8 μl DNA-Template [40 ng/μl] und 7,6 μl H₂O). Führen Sie die PCR mit den folgenden Einstellungen durch: 94 °C für 2 Minuten; 35 Zyklen mit 94 °C für 30 s, 60 °C für 30 s, 72 °C für 30 s; 72 °C für 2 Min.
7. Beurteilen Sie die Qualität von PCR-Produkten durch Elektrophorese auf einem 2,0%igen Agarosegel ^5,9 und bestätigen Sie die Zielsequenz durch Sanger-Sequenzierung.
8. Reinigen Sie das PCR-Produkt mit dem Gel-Extraktionskit gemäß den Richtlinien des Herstellers ^9,23.
9. Verwenden Sie ein RNAi-System zur Synthese von dsRNA für das Zielgen mit 10 μl 2x-Puffer (0,02 U/μl), 8 μl DNA-Template (75 ng/μl) und 2 μl Enzymmischung (1 U/50 μl) mit den folgenden Einstellungen: 37 °C für 30 min, 70 °C für 10 min und 25 °C für 20 min. Eluieren Sie die synthetisierte dsRNA mit 30 μl nukleasefreiem Wasser.
10. Beurteilen Sie die Qualität des dsRNA-Produkts, indem Sie es auf einem 1,0%igen Agarosegel^{visualisieren 5,9}. Verdünnen Sie die dsRNA auf 7.000 ng/μl. Überprüfen Sie die Qualität des dsRNA-Produkts. Fahren Sie fort, wenn der Wert von OD260/OD280 zwischen 1,8 und 2,0⁹ liegt. Lagern Sie das dsRNA-Produkt bis zur Verwendung bei -20 °C.

3. Transplantation von T. denrolimi-Puppen

1. Kultivieren Sie die parasitierten Wirtseier etwa 8 Tage lang bei 25 ± 1 °C und halten Sie dabei einen 16-stündigen Licht-/8-Stunden-Dunkelzyklus und eine relative Luftfeuchtigkeit von ~75 % ein. Die parasitierten Wirtseier werden nach 5 Tagen schwarz³⁰ (Abbildung 1-iv,v).
2. Übertragen Sie die Wirtseikarte in ein Seziermikroskop. Verwenden Sie ein Paar Wolframnadeln (Abbildung 1-vi), um das Chorion sorgfältig aus den Wirtseiern zu entfernen (Abbildung 1-vii) und die Puppe von innen zu entnehmen (Abbildung 1-viii)^5,17,18.
   HINWEIS: Die Spitze der Präpariernadel sollte weniger als 0,05 mm betragen.
3. Bereiten Sie eine saubere Platte für den Untergrund vor. Gießen Sie 10-15 ml einer 15 g/l Agarlösung aus und lassen Sie sie auf natürliche Weise abkühlen (Abbildung 2-i).
   HINWEIS: Mischen Sie die Agarlösung mit 0,5 g Streptomycin, um das Wachstum von Verunreinigungen in vitro zu hemmen.
4. Verwenden Sie einen desinfizierten Stichel, um mehrere Rillen mit einer Tiefe von 0,2 bis 0,3 mm und einer Breite von 0,4 bis 0,8 mm zu ätzen (Abbildung 2-ii).
5. Verwenden Sie eine kleine Bürste (Abbildung 2-iii), um eine Puppe aus dem sezierten Wirtseier in eine der Rillen auf dem Agarsubstrat zu transplantieren (Abbildung 2-iv).
6. Wiederholen Sie die Schritte 3.4 und 3.5 und verpflanzen Sie nacheinander 100-300 Puppen einzeln in die Rillen (Abbildung 2-v).

4. Mikroinjektion von dsRNA in T. denrolimi-Puppe

1. Verwenden Sie einen Glasnadelzieher, um eine Glaskapillare zu ziehen (Abbildung 3-i, ii). Stellen Sie die Hitze auf 280, die Geschwindigkeit auf 170, die Verzögerung auf 250 und den Zug auf 30 an einem Nadelabzieher ein (Abbildung 3-iii). Bereiten Sie mehrere Kapillarglasnadeln für die Mikroinjektion vor (Abbildung 3-iv,v).
2. Schrägen Sie die Spitze der Glasnadel mit einer Schleifplatte ab (Abbildung 3-vi).
   Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass die Spitze der Injektionsnadel scharf bleibt; Andernfalls kann es zur Puppensterblichkeit führen oder den Reagenzfluss durch die Nadel behindern (Abbildung 3-vii).
3. Laden Sie etwa 2 μl der dsRNA-Injektionslösung mit 7.000 ng/μl mit einer Mikroinjektionspumpe in die vorbereitete Injektionsnadel (Abbildung 3-vii).
4. Übertragen Sie das Agarsubstrat mit Hunderten von Puppen auf die Plattform eines Verbundmikroskops (Abbildung 3-viii).
5. Führen Sie die Injektionsnadel vorsichtig in einem Winkel von ~30° zum Bauch unter der Linse in den Bauch einer T. denrolimi-Puppe ein (Abbildung 3-ix).
6. Nach und nach ~5 nL der Injektionslösung (Schritt 4.3) so sanft wie möglich in die T. denrolimi-Puppe injizieren.
   HINWEIS: Die T. denrolimi-Puppe kann leicht anschwellen, wenn die dsRNA-Lösung injiziert wird. Das Injizieren einer übermäßigen Menge Lösung in die Puppe oder die Verwendung von Nadeln mit zu großen Öffnungen kann zum vorzeitigen Tod der Puppe führen. Wechseln Sie die Nadeln, wenn sie nach der Injektion mehrerer bis zehn Puppen verstopft sind.
7. Wiederholen Sie die Schritte 4.5 und 4.6 und injizieren Sie dsRNA nacheinander in 600 Puppen.
   HINWEIS: Für eine zuverlässige RT-qPCR-Analyse sollte der RNA-Gehalt aus mindestens 100 Puppen isoliert werden. Injizieren Sie mindestens 600 Puppen für drei Replikate in der dsRNA-Behandlung und drei Replikate in der dsGFP-Negativkontrolle ⁹.

5. Inkubation von T. denrolimi-Puppen

1. Das Substrat mit den injizierten Puppen wird bei 25 ± 1 °C mit einem Hell-/Dunkelzyklus von 16 h/8 h und ~75 % relativer Luftfeuchtigkeit in einen Inkubator überführt.
2. Inkubieren Sie etwa 700 T. denrolimi-Puppen pro Behandlung für entweder 24 Stunden oder 48 Stunden. Extrahieren Sie den RNA-Gehalt aus einer Gruppe von 100 Puppen pro Replikat⁹.
   HINWEIS: Entfernen Sie die geschrumpften Puppen (tote Puppen) aus den Proben; Andernfalls kann es zu Fehlern beim Nachweis der Genexpression kommen.
3. Inkubieren Sie ~50 T. denrolimi-Puppen pro Behandlung, bis die Wespen schlüpfen (Abbildung 3-x). Notieren Sie die Emergenzrate und die Deformitätsrate.

6. Nachweis der gezielten Genexpression

1. Entwerfen Sie das Primer-Set für das Zielgen und die Referenzgene für die RT-qPCR mit einem Design-Tool.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich die Sequenzen der RT-qPCR-Primer nicht mit der Zielregion der dsRNA überlappen.
2. Verwenden Sie das Gen Forkhead Box O (FoxO) als Referenzgen in der RT-qPCR-Analyse. über die Primer von FoxO wurde bereits berichtet⁹.
3. Besorgen Sie sich kommerziell synthetisierte Primer-Sets. Durchführung der RT-qPCR mit 10 μl Taq II (1 U/50 μl), 0,8 μl Vorwärtsprimer (0,4 μM), 0,8 μl Reverse-Primer (0,4 μM), 0,8 μl Template (10 ng/μl) und 7,6 μl H₂O. Durchführung der RT-qPCR mit den folgenden Einstellungen: 95 °C für 30 s; 35 Zyklen mit 95 °C für 5 s, 57 °C für 30 s, 72 °C für 30; 95 °C für 10 s; 60 °C für 5 s und 95 °C für 5 s.
4. Berechnen Sie den Expressionswert des Zielgens mit der ^{2-ΔΔCt-Methode 9,25}.
5. Verwenden Sie den Kruskal-Wallis-Test, um die Expression des Zielgens unter dem Einfluss verschiedener Behandlungen (dsFerhch, dsGFP, Nicht-Injektion) zu analysieren.
   HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung parametrischer Tests (z. B. t-Test) für Post-hoc-Vergleiche, da die Heteroskedastizität und Nicht-Normalität der Daten zu falschen Schlussfolgerungen führen können²⁵.

Ergebnisse

Die Emergenzrate von T. denrolimi-Puppen , denen dsFerhch injiziert wurde, war signifikant niedriger als die von denjenigen, denen dsGFP injiziert wurde, oder derjenigen, denen dsGFP injiziert wurde (Tabelle 1). Unter den geschlüpften Wespen entwickelten 51,85 % der T. denrolimi-Wespen , die dsFerhch ausgesetzt waren, deformierte kleine Flügel. Die deformierten Wespen wurden bei den Wespen, denends GFP injiziert wurde, oder ohne Injektion nicht beob...

Diskussion

Trichogramma-Wespen sind als wirksame biologische Bekämpfungsmittel anerkannt, die speziell auf eine Reihe von Lepidoptera-Schädlingen in der Land- und Forstwirtschaft abzielen¹. Diese winzigen Wespen durchlaufen ihre unreifen Stadien im Wirtsei, eine Eigenschaft, die bei der Durchführung von RNAi-Experimenten eine Herausforderung darstellt ^5,18. Diese Studie bietet einen umfassenden visuellen Leitfaden für die Durchführung v...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x ES Taq MasterMix (Dye)	Cowin Biotech, China	CW0690H	To amplify the dsRNA sequences
20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6)	Sangon Biotech, China	B540627-0500	To dilute dsRNA
Agar strip	Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China	n/a	To make culture medium
Ampicillin sodium	Sangon Biotech, China	A610028	To make culture medium
Bioer Constant temperature metal bath	BIOER, China	MB-102	To synthesis dsRNA
Borosilicate glass capillary	WPI, USA	1B100-4	To pull capillary glass needle
Clean bench	Airtech, China	SW-CJ-1FD	To extract RNA
Double distilled water	Sangon Biotech, China	A500197-0500	To dilute cDNA
Environmental Testing chamber	Panasonic, Japan	MLR-352H-PC	To culture T. denrolimi
Eppendorf Centrifuge	Eppendrof, Germany	5418R	To store RNA content
Eppendorf FemtoJet 4i	Eppendrof, Germany	FemtoJet 4i	To inject T. denrolimi
Eppendorf Refrigerated Centrifuge	Eppendrof, Germany	5810R	Centrifuge
Ethanol solution (75%, RNase-free)	Aladdin, China	M052131-500ml	To extract RNA
Gel Extraction Kit	Omega, USA	D25000-02	To extract cDNA
GUM Arabic	Solarbio, China	CG5991-500g	To make egg card
Isopropyl alchohol	Aladdin, China	80109218	To extract RNA
Laser-Based Micropipette Puller	SUTTER, USA	P-2000	To pull capillary glass needle
Microloader	Eppendrof, Germany	20 µL	To load dsRNA
Multi-sample tissue grinder	LICHEN, China	LC-TG-24	To grind T. denrolimi
Needle Grinder	SUTTER, USA	BV-10-E	To grind capillary glass needle
Nuclease-Free Water	Sangon Biotech, China		To dilute RNA
OLYMPUS Microscope	OLYMPUS, Japan	XZX16	To observe T. denrolimi
PCR machine	Bio-rad, USA	S-1000	For DNA amplification
PowerPac Basic	Bio-rad, USA	PowerPacTM Basic	To detect the quality of dsRNA
Primer of dsGFP (Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA
Primer of dsGFP (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG
Primer of Ferhch for qPCR (Forward)			TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT
Primer of Ferhch for qPCR (Reverse)			CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT
Primer of Ferhch for RNAi (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC
Primer of Ferhch for RNAi(Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG
Primer of FoxO for qPCR (Forward)			CTACGCCGATCTCATAACGC
Primer of FoxO for qPCR (Reverse)			TGCTGTCGCCCTTGTCCT
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)	TaKaRa, Japan	RR047A
Quantitative Real-time PCR	Bio-rad, USA	CFX 96 Touch	To perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Tool			https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/
T7 RiBoMAX Express RNAi System	Promega, USA	P1700	To synthesis dsRNA  in vitro
TB Green Premix Ex TaqTM (Til RnaseH Plus)	TaKaRa, Japan	RR820A	To perform RT-qPCR
Trichloromethane	KESHI, China	GB/T682-2002	To extract RNA
TRIzol Reagent	Ambion, USA	15596018	To extract total RNA content from samples
Ultra-low Temperature Freezer	Thermo, USA	Forma 911