RNA-Interferenz im Ei-Parasitoiden, Trichogramma dendrolimi matsumura

Zusammenfassung

Die Manipulation der RNA-Interferenz (RNAi) stellt bei vielen parasitoiden Arten mit geringer Größe, wie z. B. Trichogramma-Wespen , eine gewaltige Herausforderung dar. Diese Studie beschrieb eine effiziente RNAi-Methode in Trichogramma denrolimi. Die vorliegende Methodik bietet ein robustes Modell für die Untersuchung der Genregulation bei Trichogramma-Wespen .

Zusammenfassung

Die Eiparasitoide, Trichogramma spp., sind als wirksame biologische Schädlingsbekämpfungsmittel gegen verschiedene Schmetterlingsschädlinge in Land- und Forstwirtschaft anerkannt. Die unreifen Stadien der Trichogramma-Nachkommen entwickeln sich innerhalb des Wirteis und weisen eine bemerkenswerte Winzigkeit auf (ca. 0,5 mm in der adulten Länge). Die RNA-Interferenz-Methode (RNAi) hat sich als entscheidendes Werkzeug zur Aufklärung von Genfunktionen in zahlreichen Organismen herausgestellt. Die Manipulation von RNAi in bestimmten kleinen parasitoiden Arten wie Trichogramma hat jedoch im Allgemeinen erhebliche Herausforderungen mit sich gebracht. In dieser Studie stellen wir eine effiziente RNAi-Methode in Trichogramma denrolimi vor. Das skizzierte Verfahren umfasst die Gewinnung und Isolierung einzelner T. dendrolimi-Proben aus Wirtseiern, das Design und die Synthese von doppelsträngiger RNA (dsRNA), die In-vitro-Transplantation und Kultivierung von T. dendrolimi-Puppen , die Mikroinjektion von dsRNA und die anschließende Beurteilung des Zielgen-Knockdowns durch RT-qPCR-Analyse. Diese Studie liefert ein umfassendes, visuell detailliertes Verfahren zur Durchführung von RNAi-Experimenten in T. dendrolimi und ermöglicht es den Forschern, die Genregulation in dieser Art zu untersuchen. Darüber hinaus ist diese Methodik mit geringfügigen Anpassungen für RNAi-Studien oder Mikroinjektionen in anderen Trichogramma-Arten anpassbar, was sie zu einer wertvollen Referenz für die Durchführung von RNAi-Experimenten an anderen endoparasitären Arten macht.

Einleitung

Trichogramma spp. sind eine Gruppe von Eiparasitoiden, die als hocheffiziente biologische Bekämpfungsmittel gegen ein breites Spektrum von Lepidoptera-Schädlingen in land- und forstwirtschaftlichen Ökosystemen weltweit eingesetzt wurden 1,2,3,4. Die Anwendung von Trichogramma aus Massenzucht bietet einen umweltfreundlichen Ansatz für die nachhaltige Bekämpfung von Schädlingen ^5,6,7. Das Verständnis der Molekularbiologie von Tri....

Protokoll

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Instrumenten, Software und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Sammlung und Pflege von Insektenkulturen

1. Kleben Sie eine Gruppe von ~5.000 Eiern Corcyra cephalonica (Stainton) auf eine 9 cm x 16 cm große Karte mit einer 1:5 (v/v) Lösung aus Gummi arabicum-Pulver und Wasser^25,26.
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, zu viele Wirtseier an der Karte anzubringen, da die Überfüllung sie für nachfolgende Transfer- und Seziervorgänge unpraktisch macht.<....

Diskussion

Trichogramma-Wespen sind als wirksame biologische Bekämpfungsmittel anerkannt, die speziell auf eine Reihe von Lepidoptera-Schädlingen in der Land- und Forstwirtschaft abzielen¹. Diese winzigen Wespen durchlaufen ihre unreifen Stadien im Wirtsei, eine Eigenschaft, die bei der Durchführung von RNAi-Experimenten eine Herausforderung darstellt ^5,18. Diese Studie bietet einen umfassenden visuellen Leitfaden für die Durchführung v.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x ES Taq MasterMix (Dye)	Cowin Biotech, China	CW0690H	To amplify the dsRNA sequences
20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6)	Sangon Biotech, China	B540627-0500	To dilute dsRNA
Agar strip	Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China	n/a	To make culture medium
Ampicillin sodium	Sangon Biotech, China	A610028	To make culture medium
Bioer Constant temperature metal bath	BIOER, China	MB-102	To synthesis dsRNA
Borosilicate glass capillary	WPI, USA	1B100-4	To pull capillary glass needle
Clean bench	Airtech, China	SW-CJ-1FD	To extract RNA
Double distilled water	Sangon Biotech, China	A500197-0500	To dilute cDNA
Environmental Testing chamber	Panasonic, Japan	MLR-352H-PC	To culture T. denrolimi
Eppendorf Centrifuge	Eppendrof, Germany	5418R	To store RNA content
Eppendorf FemtoJet 4i	Eppendrof, Germany	FemtoJet 4i	To inject T. denrolimi
Eppendorf Refrigerated Centrifuge	Eppendrof, Germany	5810R	Centrifuge
Ethanol solution (75%, RNase-free)	Aladdin, China	M052131-500ml	To extract RNA
Gel Extraction Kit	Omega, USA	D25000-02	To extract cDNA
GUM Arabic	Solarbio, China	CG5991-500g	To make egg card
Isopropyl alchohol	Aladdin, China	80109218	To extract RNA
Laser-Based Micropipette Puller	SUTTER, USA	P-2000	To pull capillary glass needle
Microloader	Eppendrof, Germany	20 µL	To load dsRNA
Multi-sample tissue grinder	LICHEN, China	LC-TG-24	To grind T. denrolimi
Needle Grinder	SUTTER, USA	BV-10-E	To grind capillary glass needle
Nuclease-Free Water	Sangon Biotech, China		To dilute RNA
OLYMPUS Microscope	OLYMPUS, Japan	XZX16	To observe T. denrolimi
PCR machine	Bio-rad, USA	S-1000	For DNA amplification
PowerPac Basic	Bio-rad, USA	PowerPacTM Basic	To detect the quality of dsRNA
Primer of dsGFP (Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA
Primer of dsGFP (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG
Primer of Ferhch for qPCR (Forward)			TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT
Primer of Ferhch for qPCR (Reverse)			CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT
Primer of Ferhch for RNAi (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC
Primer of Ferhch for RNAi(Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG
Primer of FoxO for qPCR (Forward)			CTACGCCGATCTCATAACGC
Primer of FoxO for qPCR (Reverse)			TGCTGTCGCCCTTGTCCT
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)	TaKaRa, Japan	RR047A
Quantitative Real-time PCR	Bio-rad, USA	CFX 96 Touch	To perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Tool			https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/
T7 RiBoMAX Express RNAi System	Promega, USA	P1700	To synthesis dsRNA  in vitro
TB Green Premix Ex TaqTM (Til RnaseH Plus)	TaKaRa, Japan	RR820A	To perform RT-qPCR
Trichloromethane	KESHI, China	GB/T682-2002	To extract RNA
TRIzol Reagent	Ambion, USA	15596018	To extract total RNA content from samples
Ultra-low Temperature Freezer	Thermo, USA	Forma 911