РНК-интерференция в яйцеклетке паразитоида, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Резюме

Манипулирование РНК-интерференцией (РНК-интерференцией) представляет собой серьезную проблему для многих паразитоидных видов с миниатюрными размерами, таких как осы Trichogramma . В этом исследовании описан эффективный метод РНК-интерференции у Trichogramma denrolimi. Данная методология представляет собой надежную модель для исследования регуляции генов у ос типа Trichogramma .

Аннотация

Паразитоиды яиц, Trichogramma spp, признаны эффективными биологическими средствами борьбы с различными чешуекрылыми вредителями в сельском хозяйстве и лесах. Незрелые стадии потомства Trichogramma развиваются в яйцеклетке хозяина, демонстрируя замечательную миниатюрность (примерно 0,5 мм в длину взрослой особи). Методология РНК-интерференции (РНК-интерференции) стала важнейшим инструментом для выяснения функций генов во многих организмах. Тем не менее, манипулирование РНК-интерференцией у некоторых мелких паразитоидных видов, таких как Trichogramma, в целом представляет значительные проблемы. В данном исследовании мы представляем эффективный метод РНК-интерференции при Trichogramma denrolimi. Описанная процедура включает в себя получение и изоляцию отдельных образцов T. dendrolimi из яйцеклеток хозяина, конструирование и синтез двухцепочечной РНК (дцРНК), трансплантацию in vitro и культивирование куколок T. dendrolimi , микроинъекцию дцРНК и последующую оценку нокдауна гена-мишени с помощью анализа ОТ-кПЦР. Это исследование представляет собой всеобъемлющую, наглядно детализированную процедуру проведения экспериментов с РНК-интерференцией у T. dendrolimi, что позволяет исследователям исследовать регуляцию генов у этого вида. Кроме того, эта методология может быть адаптирована для исследований РНК-интерференции или микроинъекций у других видов трихограмм с незначительными корректировками, что делает ее ценным справочным материалом для проведения экспериментов с РНК-интерференцией у других эндопаразитических видов.

Введение

Trichogramma spp. представляет собой группу яичных паразитоидов, которые широко используются в качестве высокоэффективных средств биологической борьбы с широким спектром чешуекрылых вредителей в сельскохозяйственных и лесных экосистемах по всему миру 1,2,3,4. Применение трихограммы массового выращивания обеспечивает экологически чистый подход к устойчивой борьбе с вредителями ^5,6,7. Понимание молекулярной биологии ос Trichogramma дает ценную информацию о повышении эффективности массового выращивания и производительности этих агентов биологического контроля в полевых условиях ^8,9 путем изучения методологии регуляции генов и редактирования^{генома 10}.

С момента открытия в 1998 г. двухцепочечной РНК-опосредованной специфической генетической интерференции у Caenorhabditis elegans метод РНК-интерференции (РНК-интерференции) превратился в жизненно важный генетический инструментарий для изучения регуляторных механизмов организмов путем подавления экспрессии генов-мишеней¹¹. Эксперименты с РНК-интерференцией стали стандартной методологией, широко применяемой для изучения функции генов у многочисленных видов насекомых^12,13. Тем не менее, манипулирование РНК-интерференцией представляет собой серьезную проблему для многих паразитоидных видов, особенно среди тех, которые принадлежат к эндопаразитическому семейству Chalcidoidea 14,15,16. Метод РНК-интерференции был задокументирован по меньшей мере у 13 паразитоидных видов^{: 14,15,16,17,18,19}. Среди них РНК-интерференционный подход был всесторонне проведен на осах Nasonia и применим на всех стадиях развития, включая эмбрионы, личинки, куколки и взрослых особей 14,15,16. Примечательно, что осы Nasonia являются эктопаразитоидами, их потомство развивается в междоузлиевом пространстве между куколкой-хозяином и пупарием, что позволяет их культивировать in vitro и заставляет их переносить определенные методы лечения, такие как микроинъекции. В отличие от ос Nasonia, особи Trichogramma проходят все свое эмбриональное, личиночное и куколочное развитие внутри яйца хозяина. Слой на стадиях эмбриона и личинки (который может препятствовать проницаемости дцРНК), уязвимость к повреждениям и трудности выживания in vitro представляют собой огромные препятствия 20,21,22. Кроме того, крошечный размер особей Trichogramma, примерно ~0,5 мм в длину взрослой особи или куколки, делает их чрезвычайно сложными для манипулирования 20,21,22.

В настоящем исследовании мы излагаем комплексную процедуру проведения экспериментов по РНК-интерференции (РНК-интерференции) в Trichogramma denrolimi Matsumura. Эта процедура включает в себя следующие процедуры: (1) разработка и синтез двухцепочечной РНК (дцРНК), (2) микроинъекция куколок T. denrolimi, (3) трансплантация и инкубация этих куколок in vitro и (4) обнаружение нокдауна гена-мишени с помощью анализа ОТ-кПЦР. Геном-мишенью, выбранным для эксперимента с РНК-интерференцией, является гомология тяжелой цепи ферритина (Ferhch). ФерГХГ, железосвязывающий белок, содержит феррокидазный центр, наделенный антиоксидантными способностями, облегчая окисление Fe²⁺ до Fe³⁺. Он играет незаменимую роль в росте и развитии различных организмов, поддерживая окислительно-восстановительное равновесие и гомеостаз железа. Истощение FerHCH может привести к чрезмерному накоплению железа, что приводит к необратимому повреждению тканей и часто приводит к значительным фенотипическим изменениям, включая дефекты роста, деформации и смертность^23,24. Это исследование предлагает пошаговое руководство по проведению РНК-интерференции у T. denrolimi, которое будет иметь неоценимое значение для изучения функций генов в более широком контексте ос Trichogramma.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации, относящейся ко всем материалам, инструментам, программному обеспечению и реагентам, используемым в этом протоколе.

1. Сбор и поддержание культуры насекомых

1. Приклейте группу из ~5 000 яиц Corcyra cephalonica (Stainton) на карту размером 9 см на 16 см, используя раствор 1:5 (v/v) порошка гуммиарабика и воды^25,26.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикрепляйте слишком много яйцеклеток хозяина к карте, так как переполненность делает ее непрактичной для последующих процедур переноса и вскрытия.
2. Чтобы предотвратить вылупление яиц хозяина, подвергните карточки яиц хозяина 30-минутному ультрафиолетовому (УФ) облучению (рисунок 1-i). Затем разрежьте бумагу с инактивированными яйцами на карточки для яиц толщиной 1 см и диаметром 8 см, каждая из которых содержит примерно 300-500 яиц (рис. 1-ii)25,26,27.
3. Ввести когорту из 80-120 ос T. denrolimi в стеклянную трубку диаметром 2 см и длиной 8 см. Заклейте трубочку ватой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте ос при температуре 25 ± 1 °C, с циклом света/темноты 16 часов света и 8 часов темноты и поддерживайте относительную влажность около 75%.
4. Предъявите осам карточку с яйцом хозяина для паразитирования (рис. 1-ii). Дайте осам отложить яйца в яйца хозяина в течение 6 часов, после чего немедленно удалите ос.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте чрезмерного удлинения периода паразитирования, так как это может привести к скученности потомства T. denrolimi в яйце хозяина, что приведет к увеличению смертности потомства ос^28,29.

2. Синтез дцРНК

1. Разработка наборов праймеров, содержащих промотор Т7 для синтеза двухцепочечной РНК (дцРНК). Выберите сегмент длиной 300-400.о. из гена-мишени (Ferhch) для синтеза дцРНК.
2. Приобретение коммерчески синтезированных наборов праймеров для производства дцРНК для целевого гена и dsGFP для использования в качестве негативного контроля.
3. Извлеките содержание РНК из 100 ос T. denrolimi с помощью указанного набора в соответствии с протоколом производителя⁹. Проверить качество содержания РНК; продолжить, если значение OD260/OD280 находится в диапазоне от 1,8 до 2,0⁹.
4. Очищают содержание РНК 2 мкл 5-кратного буфера (1 U/50 мкл), 1 мкл ДНКазы (1 U/50 мкл) и 6,5 мкл РНК (~100 нг/мкл), 0,5 мкл_H2Oпри 42 °C в течение 2 мин.
5. Проведите полимеразную цепную реакцию с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) для создания матрицы кДНК с 10 мкл очищенной РНК (~100 нг/мкл), 4 мкл 5-кратного буфера (1 U/50 мкл), 1 мкл смеси ферментов I (1 U/50 мкл) и 4 мкл H2O. Выполняйте ОТ-ПЦР со следующиминастройками: 37 °C в течение 15 мин, 85 °C в течение 5 с. Храните продукт кДНК при температуре -4 °C до использования.
6. Проводят полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для амплификации последовательностей дцРНК в соответствии с эталонной мастер-смесью (10 мкл Taq II [1 U/50 мкл], 0,8 мкл прямого праймера [0,4 мкМ], 0,8 мкл обратного праймера [0,4 мкМ], 0,8 мкл матрицы ДНК [40 нг/мкл] и 7,6 мкл H₂O). Выполняйте ПЦР со следующими настройками: 94 °C в течение 2 мин; 35 циклов при 94 °C в течение 30 с, 60 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 30 с; 72 °C в течение 2 мин.
7. Оценивают качество продуктов ПЦР методом электрофореза на 2,0% агарозном геле ^5,9 и подтверждают целевую последовательность с помощью секвенирования по Сэнгеру.
8. Очистите продукт ПЦР с помощью набора для экстракции геля в соответствии с рекомендациями производителя ^9,23.
9. Используйте систему РНК-интерференции для синтеза дцРНК для гена-мишени с 10 мкл 2-кратного буфера (0,02 U/мкл), 8 мкл матрицы ДНК (75 нг/мкл) и 2 мкл смеси ферментов (1 U/50 мкл) со следующими настройками: 37 °C в течение 30 мин, 70 °C в течение 10 мин и 25 °C в течение 20 мин. Элюируют синтезированную дцРНК с помощью 30 мкл воды, не содержащей нуклеаз.
10. Оценивают качество продукта дцРНК, визуализируя его на 1,0% агарозном геле ^5,9. Разбавить дцРНК до 7 000 нг/мкл. Проверить качество продукта дцРНК; продолжить, если значение OD260/OD280 находится в диапазоне от 1,8 до 2,0⁹. Храните продукт дцРНК при температуре -20 °C до использования.

3. Трансплантация куколок T. denrolimi

1. Культивировать яйца паразитированных хозяев в течение примерно 8 дней при температуре 25 ± 1°C, поддерживая цикл 16 ч светлый/8 ч темноты и относительную влажность ~75%. Яйца паразитированного хозяина чернеют через 5 дней³⁰ (рис. 1-iv,v).
2. Перенесите яйцеклетку хозяина в препарирующий микроскоп. Используйте пару вольфрамовых игл (Рисунок 1-vi), чтобы тщательно удалить хорион из яиц хозяина (Рисунок 1-vii) и извлечь куколку изнутри (Рисунок 1-viii)^5,17,18.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кончик иглы для препарирования должен быть менее 0,05 мм.
3. Подготовьте чистую тарелку для субстрата. Вылейте 10-15 мл 15 г/л раствора агара, дав ему естественным образом остыть (рис. 2-i).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Смешайте раствор агара с 0,5 г стрептомицина, чтобы подавить рост загрязняющих веществ in vitro.
4. С помощью продезинфицированного гравера протравить несколько канавок глубиной 0,2-0,3 мм и шириной 0,4-0,8 мм (рис. 2-ii).
5. С помощью маленькой кисточки (Рисунок 2-III) пересадите куколку из препарированного яйца хозяина в одну из бороздок на агаровом субстрате (Рисунок 2-iv).
6. Повторите шаги 3.4 и 3.5, пересаживая 100-300 куколок по отдельности в бороздки одну за другой (рис. 2-v).

4. Микроинъекция дцРНК в куколку T. denrolimi

1. Используйте съемник стеклянной иглы, чтобы потянуть стеклянный капилляр (Рисунок 3-i, ii). Установите нагрев на 280, скорость на 170, задержку на 250 и тягу на 30 на съемнике иглы (рис. 3-iii). Подготовьте несколько капиллярных стеклянных игл для микроинъекций (рис. 3-iv, v).
2. Скосите кончик стеклянной иглы с помощью абразивной пластины (рисунок 3-vi).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что кончик инъекционной иглы остается острым; в противном случае это может привести к падежу куколки или затруднить поток реагента через иглу (рис. 3-vii).
3. Загрузите примерно 2 мкл раствора для инъекций дцРНК с концентрацией 7 000 нг/мкл в подготовленную инъекционную иглу с помощью микроинжекционного насоса (рис. 3-vii).
4. Перенесите агаровую подложку, содержащую сотни куколок, на платформу составного микроскопа (рис. 3-viii).
5. Осторожно введите инъекционную иглу в брюшную полость куколки T. denrolimi под углом ~30° к брюшной полости под линзой (рис. 3-ix).
6. Постепенно вводите ~5 нл раствора для инъекций (шаг 4.3) в куколку T. denrolimi как можно осторожнее.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Куколка T. denrolimi может слегка набухать при введении раствора дцРНК. Введение чрезмерного количества раствора в куколку или использование игл с слишком большими отверстиями может привести к преждевременной гибели куколки. Меняйте иглы, когда они забиваются после введения от нескольких до десятков куколок.
7. Повторите шаги 4.5 и 4.6, вводя дцРНК в 600 куколок одну за другой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для надежного анализа ОТ-кПЦР содержание РНК должно быть выделено не менее чем из 100 куколок. Введите не менее 600 куколок для трех репликаций при лечении дцРНК и трех репликатов в отрицательном контроле dsGFP ⁹.

5. Инкубация куколок T. denrolimi

1. Перенесите субстрат, содержащий введенных куколок, в инкубатор при температуре 25 ± 1 °C с циклом свет/темнота 16 ч/8 ч и относительной влажностью ~75%.
2. Инкубируйте около 700 T. denrolimi куколок за одну обработку в течение 24 ч или 48 ч. Извлечение содержимого РНК из группы из 100 куколок на репликат⁹.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите сморщенные куколки (мертвые куколки) из образцов; В противном случае это может привести к ошибкам в обнаружении экспрессии генов.
3. Инкубируйте ~50 T. denrolimi куколок за одну обработку, пока не появятся осы (рис. 3-x). Запишите частоту появления и частоту деформации.

6. Обнаружение целевой экспрессии генов

1. Разработайте набор праймеров для гена-мишени и референсных генов для ОТ-кПЦР с помощью инструмента проектирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы последовательности праймеров RT-qPCR не перекрывались с целевым участком дцРНК.
2. Используйте ген вилочной коробки O (FoxO) в качестве референсного гена в анализе ОТ-кПЦР; ранее сообщалось о праймерах FoxO ⁹.
3. Получение коммерчески синтезированных наборов праймеров. Выполняйте ОТ-кПЦР с 10 мкл Taq II (1 U/50 мкл), 0,8 мкл прямого праймера (0,4 мкМ), 0,8 мкл обратного праймера (0,4 мкМ), 0,8 мкл шаблона (10 нг/мкл) и 7,6 мкл_H2O. Выполняйте ОТ-кПЦР со следующими настройками: 95 °C в течение 30 с; 35 циклов при 95 °C в течение 5 с, 57 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 30 с; 95 °С в течение 10 с; 60 °C в течение 5 с и 95 °C в течение 5 с.
4. Рассчитайте значение экспрессии целевого гена с помощью метода ^{2-ΔΔCt 9,25}.
5. Используйте тест Краскела-Уоллиса для анализа экспрессии гена-мишени под влиянием различных методов лечения (dsFerhch, dsGFP, без инъекций).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования параметрических тестов (например, t-критерия) для сравнений post-hoc, так как гетероскедастичность и ненормальность данных могут привести к ошибочным выводам²⁵.

Результаты

Частота появления куколок T. denrolimi , которым вводили dsFerhch, была значительно ниже, чем у тех, кому вводили dsGFP или которым не вводили (табл. 1). Среди появившихся ос у 51,85% ос T. denrolimi , подвергшихся dsFerhch , развились деформированные мелкие крылья. Деформированные ...

Обсуждение

Осы трихограммы признаны эффективными средствами биологической борьбы, особенно нацеленными на ряд чешуекрылых вредителей в сельском и лесном хозяйстве¹. Эти миниатюрные осы проходят свои незрелые стадии в яйце хозяина, что создает проблемы при проведении экспериме...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x ES Taq MasterMix (Dye)	Cowin Biotech, China	CW0690H	To amplify the dsRNA sequences
20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6)	Sangon Biotech, China	B540627-0500	To dilute dsRNA
Agar strip	Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China	n/a	To make culture medium
Ampicillin sodium	Sangon Biotech, China	A610028	To make culture medium
Bioer Constant temperature metal bath	BIOER, China	MB-102	To synthesis dsRNA
Borosilicate glass capillary	WPI, USA	1B100-4	To pull capillary glass needle
Clean bench	Airtech, China	SW-CJ-1FD	To extract RNA
Double distilled water	Sangon Biotech, China	A500197-0500	To dilute cDNA
Environmental Testing chamber	Panasonic, Japan	MLR-352H-PC	To culture T. denrolimi
Eppendorf Centrifuge	Eppendrof, Germany	5418R	To store RNA content
Eppendorf FemtoJet 4i	Eppendrof, Germany	FemtoJet 4i	To inject T. denrolimi
Eppendorf Refrigerated Centrifuge	Eppendrof, Germany	5810R	Centrifuge
Ethanol solution (75%, RNase-free)	Aladdin, China	M052131-500ml	To extract RNA
Gel Extraction Kit	Omega, USA	D25000-02	To extract cDNA
GUM Arabic	Solarbio, China	CG5991-500g	To make egg card
Isopropyl alchohol	Aladdin, China	80109218	To extract RNA
Laser-Based Micropipette Puller	SUTTER, USA	P-2000	To pull capillary glass needle
Microloader	Eppendrof, Germany	20 µL	To load dsRNA
Multi-sample tissue grinder	LICHEN, China	LC-TG-24	To grind T. denrolimi
Needle Grinder	SUTTER, USA	BV-10-E	To grind capillary glass needle
Nuclease-Free Water	Sangon Biotech, China		To dilute RNA
OLYMPUS Microscope	OLYMPUS, Japan	XZX16	To observe T. denrolimi
PCR machine	Bio-rad, USA	S-1000	For DNA amplification
PowerPac Basic	Bio-rad, USA	PowerPacTM Basic	To detect the quality of dsRNA
Primer of dsGFP (Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA
Primer of dsGFP (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG
Primer of Ferhch for qPCR (Forward)			TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT
Primer of Ferhch for qPCR (Reverse)			CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT
Primer of Ferhch for RNAi (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC
Primer of Ferhch for RNAi(Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG
Primer of FoxO for qPCR (Forward)			CTACGCCGATCTCATAACGC
Primer of FoxO for qPCR (Reverse)			TGCTGTCGCCCTTGTCCT
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)	TaKaRa, Japan	RR047A
Quantitative Real-time PCR	Bio-rad, USA	CFX 96 Touch	To perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Tool			https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/
T7 RiBoMAX Express RNAi System	Promega, USA	P1700	To synthesis dsRNA  in vitro
TB Green Premix Ex TaqTM (Til RnaseH Plus)	TaKaRa, Japan	RR820A	To perform RT-qPCR
Trichloromethane	KESHI, China	GB/T682-2002	To extract RNA
TRIzol Reagent	Ambion, USA	15596018	To extract total RNA content from samples
Ultra-low Temperature Freezer	Thermo, USA	Forma 911