Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Манипулирование РНК-интерференцией (РНК-интерференцией) представляет собой серьезную проблему для многих паразитоидных видов с миниатюрными размерами, таких как осы Trichogramma . В этом исследовании описан эффективный метод РНК-интерференции у Trichogramma denrolimi. Данная методология представляет собой надежную модель для исследования регуляции генов у ос типа Trichogramma .

Аннотация

Паразитоиды яиц, Trichogramma spp, признаны эффективными биологическими средствами борьбы с различными чешуекрылыми вредителями в сельском хозяйстве и лесах. Незрелые стадии потомства Trichogramma развиваются в яйцеклетке хозяина, демонстрируя замечательную миниатюрность (примерно 0,5 мм в длину взрослой особи). Методология РНК-интерференции (РНК-интерференции) стала важнейшим инструментом для выяснения функций генов во многих организмах. Тем не менее, манипулирование РНК-интерференцией у некоторых мелких паразитоидных видов, таких как Trichogramma, в целом представляет значительные проблемы. В данном исследовании мы представляем эффективный метод РНК-интерференции при Trichogramma denrolimi. Описанная процедура включает в себя получение и изоляцию отдельных образцов T. dendrolimi из яйцеклеток хозяина, конструирование и синтез двухцепочечной РНК (дцРНК), трансплантацию in vitro и культивирование куколок T. dendrolimi , микроинъекцию дцРНК и последующую оценку нокдауна гена-мишени с помощью анализа ОТ-кПЦР. Это исследование представляет собой всеобъемлющую, наглядно детализированную процедуру проведения экспериментов с РНК-интерференцией у T. dendrolimi, что позволяет исследователям исследовать регуляцию генов у этого вида. Кроме того, эта методология может быть адаптирована для исследований РНК-интерференции или микроинъекций у других видов трихограмм с незначительными корректировками, что делает ее ценным справочным материалом для проведения экспериментов с РНК-интерференцией у других эндопаразитических видов.

Введение

Trichogramma spp. представляет собой группу яичных паразитоидов, которые широко используются в качестве высокоэффективных средств биологической борьбы с широким спектром чешуекрылых вредителей в сельскохозяйственных и лесных экосистемах по всему миру 1,2,3,4. Применение трихограммы массового выращивания обеспечивает экологически чистый подход к устойчивой борьбе с вредителями 5,6,7. Понимание молекулярной биологии ос Trichogram....

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации, относящейся ко всем материалам, инструментам, программному обеспечению и реагентам, используемым в этом протоколе.

1. Сбор и поддержание культуры насекомых

  1. Приклейте группу из ~5 000 яиц Corcyra cephalonica (Stainton) на карту размером 9 см на 16 см, используя раствор 1:5 (v/v) порошка гуммиарабика и воды25,26.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикрепляйте слишком много яйцеклеток хозяина к карте, так как переполненность делает ее непрактичной для последующих процедур перенос....

Результаты

Частота появления куколок T. denrolimi , которым вводили dsFerhch, была значительно ниже, чем у тех, кому вводили dsGFP или которым не вводили (табл. 1). Среди появившихся ос у 51,85% ос T. denrolimi , подвергшихся dsFerhch , развились деформированные мелкие крылья. Деформированные .......

Обсуждение

Осы трихограммы признаны эффективными средствами биологической борьбы, особенно нацеленными на ряд чешуекрылых вредителей в сельском и лесном хозяйстве1. Эти миниатюрные осы проходят свои незрелые стадии в яйце хозяина, что создает проблемы при проведении экспериме.......

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Это исследование финансировалось проектами Национального фонда естественных наук Китая (32172476, 32102275), Программой инноваций в области сельскохозяйственной науки и технологий (CAAS-ZDRW202203, CAAS-ZDRW202108) и Центральными фондами, направляющими местное научно-техническое развитие (XZ202301YD0042C).

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2x ES Taq MasterMix (Dye)Cowin Biotech, ChinaCW0690HTo amplify the dsRNA sequences
20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6)Sangon Biotech, ChinaB540627-0500To dilute dsRNA
Agar stripShishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, Chinan/aTo make culture medium
Ampicillin sodiumSangon Biotech, ChinaA610028To make culture medium
Bioer Constant temperature metal bath BIOER, ChinaMB-102To synthesis dsRNA
Borosilicate glass capillary WPI, USA1B100-4To pull capillary glass needle
Clean bench Airtech, ChinaSW-CJ-1FDTo extract RNA
Double distilled waterSangon Biotech, ChinaA500197-0500To dilute cDNA
Environmental Testing chamber Panasonic, JapanMLR-352H-PCTo culture T. denrolimi
Eppendorf Centrifuge Eppendrof, Germany5418RTo store RNA content
Eppendorf FemtoJet 4iEppendrof, GermanyFemtoJet 4iTo inject T. denrolimi
Eppendorf Refrigerated Centrifuge Eppendrof, Germany5810RCentrifuge
Ethanol solution (75%, RNase-free)Aladdin, ChinaM052131-500mlTo extract RNA
Gel Extraction KitOmega, USAD25000-02To extract cDNA
GUM ArabicSolarbio, ChinaCG5991-500gTo make egg card
Isopropyl alchoholAladdin, China80109218To extract RNA
Laser-Based Micropipette Puller SUTTER, USAP-2000To pull capillary glass needle
Microloader Eppendrof, Germany20 µLTo load dsRNA
Multi-sample tissue grinder LICHEN, ChinaLC-TG-24To grind T. denrolimi
Needle Grinder SUTTER, USABV-10-ETo grind capillary glass needle
Nuclease-Free WaterSangon Biotech, ChinaTo dilute RNA
OLYMPUS MicroscopeOLYMPUS, JapanXZX16To observe T. denrolimi
PCR machine Bio-rad, USAS-1000For DNA amplification
PowerPac BasicBio-rad, USAPowerPacTM BasicTo detect the quality of dsRNA 
Primer of dsGFP (Forward)[TAATACGACTCACTATAGGG]
ACAAACCAAGGCAAGTAATA
Primer of dsGFP (Reverse)[TAATACGACTCACTATAGGG]
CAGAGGCATCTTCAACG
Primer of Ferhch for qPCR (Forward)TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT
Primer of Ferhch for qPCR (Reverse)CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT
Primer of Ferhch for RNAi (Reverse)[TAATACGACTCACTATAGGG]AG
TAGCCATCATCTTTCC
Primer of Ferhch for RNAi(Forward)[TAATACGACTCACTATAGGG]
ACACTGTCAATCGTCCTG
Primer of FoxO for qPCR (Forward)CTACGCCGATCTCATAACGC
Primer of FoxO for qPCR (Reverse)TGCTGTCGCCCTTGTCCT
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)TaKaRa, JapanRR047A
Quantitative Real-time PCR Bio-rad, USACFX 96 TouchTo perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) 
Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Toolhttps://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/
T7 RiBoMAX Express RNAi SystemPromega, USAP1700To synthesis dsRNA  in vitro 
TB Green Premix Ex TaqTM figure-materials-5268 (Til RnaseH Plus)TaKaRa, JapanRR820ATo perform RT-qPCR
TrichloromethaneKESHI, ChinaGB/T682-2002To extract RNA
TRIzol ReagentAmbion, USA15596018To extract total RNA content from samples
Ultra-low Temperature Freezer Thermo, USAForma 911

Ссылки

  1. Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status and perspectives. Annu Rev Entomol. 66, 463-484 (2020).
  2. Zhou, J. C., et al.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

201

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены