In This Article

Summary

Манипулирование РНК-интерференцией (РНК-интерференцией) представляет собой серьезную проблему для многих паразитоидных видов с миниатюрными размерами, таких как осы Trichogramma . В этом исследовании описан эффективный метод РНК-интерференции у Trichogramma denrolimi. Данная методология представляет собой надежную модель для исследования регуляции генов у ос типа Trichogramma .

Abstract

Паразитоиды яиц, Trichogramma spp, признаны эффективными биологическими средствами борьбы с различными чешуекрылыми вредителями в сельском хозяйстве и лесах. Незрелые стадии потомства Trichogramma развиваются в яйцеклетке хозяина, демонстрируя замечательную миниатюрность (примерно 0,5 мм в длину взрослой особи). Методология РНК-интерференции (РНК-интерференции) стала важнейшим инструментом для выяснения функций генов во многих организмах. Тем не менее, манипулирование РНК-интерференцией у некоторых мелких паразитоидных видов, таких как Trichogramma, в целом представляет значительные проблемы. В данном исследовании мы представляем эффективный метод РНК-интерференции при Trichogramma denrolimi. Описанная процедура включает в себя получение и изоляцию отдельных образцов T. dendrolimi из яйцеклеток хозяина, конструирование и синтез двухцепочечной РНК (дцРНК), трансплантацию in vitro и культивирование куколок T. dendrolimi , микроинъекцию дцРНК и последующую оценку нокдауна гена-мишени с помощью анализа ОТ-кПЦР. Это исследование представляет собой всеобъемлющую, наглядно детализированную процедуру проведения экспериментов с РНК-интерференцией у T. dendrolimi, что позволяет исследователям исследовать регуляцию генов у этого вида. Кроме того, эта методология может быть адаптирована для исследований РНК-интерференции или микроинъекций у других видов трихограмм с незначительными корректировками, что делает ее ценным справочным материалом для проведения экспериментов с РНК-интерференцией у других эндопаразитических видов.

Introduction

Trichogramma spp. представляет собой группу яичных паразитоидов, которые широко используются в качестве высокоэффективных средств биологической борьбы с широким спектром чешуекрылых вредителей в сельскохозяйственных и лесных экосистемах по всему миру 1,2,3,4. Применение трихограммы массового выращивания обеспечивает экологически чистый подход к устойчивой борьбе с вредителями 5,6,7. Понимание молекулярной биологии ос Trichogram....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации, относящейся ко всем материалам, инструментам, программному обеспечению и реагентам, используемым в этом протоколе.

1. Сбор и поддержание культуры насекомых

  1. Приклейте группу из ~5 000 яиц Corcyra cephalonica (Stainton) на карту размером 9 см на 16 см, используя раствор 1:5 (v/v) порошка гуммиарабика и воды25,26.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикрепляйте слишком много яйцеклеток хозяина к карте, так как переполненность делает ее непрактичной для последующих процедур перенос....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Частота появления куколок T. denrolimi , которым вводили dsFerhch, была значительно ниже, чем у тех, кому вводили dsGFP или которым не вводили (табл. 1). Среди появившихся ос у 51,85% ос T. denrolimi , подвергшихся dsFerhch , развились деформированные мелкие крылья. Деформированные .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Осы трихограммы признаны эффективными средствами биологической борьбы, особенно нацеленными на ряд чешуекрылых вредителей в сельском и лесном хозяйстве1. Эти миниатюрные осы проходят свои незрелые стадии в яйце хозяина, что создает проблемы при проведении экспериме.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Acknowledgements

Это исследование финансировалось проектами Национального фонда естественных наук Китая (32172476, 32102275), Программой инноваций в области сельскохозяйственной науки и технологий (CAAS-ZDRW202203, CAAS-ZDRW202108) и Центральными фондами, направляющими местное научно-техническое развитие (XZ202301YD0042C).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2x ES Taq MasterMix (Dye)Cowin Biotech, ChinaCW0690HTo amplify the dsRNA sequences
20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6)Sangon Biotech, ChinaB540627-0500To dilute dsRNA
Agar stripShishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, Chinan/aTo make culture medium
Ampicillin sodiumSangon Biotech, ChinaA610028To make culture medium
Bioer Constant temperature metal bath BIOER, ChinaMB-102To synthesis dsRNA
Borosilicate glass capillary WPI, USA1B100-4To pull capillary glass needle
Clean bench Airtech, ChinaSW-CJ-1FDTo extract RNA
Double distilled waterSangon Biotech, ChinaA500197-0500To dilute cDNA
Environmental Testing chamber Panasonic, JapanMLR-352H-PCTo culture T. denrolimi
Eppendorf Centrifuge Eppendrof, Germany5418RTo store RNA content
Eppendorf FemtoJet 4iEppendrof, GermanyFemtoJet 4iTo inject T. denrolimi
Eppendorf Refrigerated Centrifuge Eppendrof, Germany5810RCentrifuge
Ethanol solution (75%, RNase-free)Aladdin, ChinaM052131-500mlTo extract RNA
Gel Extraction KitOmega, USAD25000-02To extract cDNA
GUM ArabicSolarbio, ChinaCG5991-500gTo make egg card
Isopropyl alchoholAladdin, China80109218To extract RNA
Laser-Based Micropipette Puller SUTTER, USAP-2000To pull capillary glass needle
Microloader Eppendrof, Germany20 µLTo load dsRNA
Multi-sample tissue grinder LICHEN, ChinaLC-TG-24To grind T. denrolimi
Needle Grinder SUTTER, USABV-10-ETo grind capillary glass needle
Nuclease-Free WaterSangon Biotech, ChinaTo dilute RNA
OLYMPUS MicroscopeOLYMPUS, JapanXZX16To observe T. denrolimi
PCR machine Bio-rad, USAS-1000For DNA amplification
PowerPac BasicBio-rad, USAPowerPacTM BasicTo detect the quality of dsRNA 
Primer of dsGFP (Forward)[TAATACGACTCACTATAGGG]
ACAAACCAAGGCAAGTAATA
Primer of dsGFP (Reverse)[TAATACGACTCACTATAGGG]
CAGAGGCATCTTCAACG
Primer of Ferhch for qPCR (Forward)TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT
Primer of Ferhch for qPCR (Reverse)CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT
Primer of Ferhch for RNAi (Reverse)[TAATACGACTCACTATAGGG]AG
TAGCCATCATCTTTCC
Primer of Ferhch for RNAi(Forward)[TAATACGACTCACTATAGGG]
ACACTGTCAATCGTCCTG
Primer of FoxO for qPCR (Forward)CTACGCCGATCTCATAACGC
Primer of FoxO for qPCR (Reverse)TGCTGTCGCCCTTGTCCT
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)TaKaRa, JapanRR047A
Quantitative Real-time PCR Bio-rad, USACFX 96 TouchTo perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) 
Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Toolhttps://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/
T7 RiBoMAX Express RNAi SystemPromega, USAP1700To synthesis dsRNA  in vitro 
TB Green Premix Ex TaqTM figure-materials-1 (Til RnaseH Plus)TaKaRa, JapanRR820ATo perform RT-qPCR
TrichloromethaneKESHI, ChinaGB/T682-2002To extract RNA
TRIzol ReagentAmbion, USA15596018To extract total RNA content from samples
Ultra-low Temperature Freezer Thermo, USAForma 911

References

  1. Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status and perspectives. Annu Rev Entomol. 66, 463-484 (2020).
  2. Zhou, J. C., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

201