A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

המניפולציה של הפרעות RNA (RNAi) מהווה אתגר עצום במינים רבים של טפילים בעלי גודל זעיר, כגון צרעות טריכוגרמה . מחקר זה התווה שיטת RNAi יעילה ב - Trichogramma denrolimi. המתודולוגיה הנוכחית מספקת מודל חזק לחקר בקרת גנים בצרעות טריכוגרמה .

Abstract

טפילי הביצה, Trichogramma spp, מוכרים כמדבירים ביולוגיים יעילים נגד מזיקים לפידופטרנים שונים בחקלאות וביערות. השלבים הלא בוגרים של צאצאי טריכוגרמה מתפתחים בתוך הביצה המארחת, ומפגינים זעירות יוצאת דופן (כ-0.5 מ"מ אורך בוגר). מתודולוגיית RNA-interference (RNAi) התפתחה ככלי חיוני להבהרת תפקודי גנים באורגניזמים רבים. עם זאת, מניפולציה של RNAi במינים מסוימים של טפילים קטנים, כגון טריכוגרמה, הציבה בדרך כלל אתגרים משמעותיים. במחקר זה אנו מציגים שיטת RNAi יעילה ב-Trichogramma denrolimi. ההליך המתואר כולל רכישה ובידוד של דגימות בודדות של T. dendrolimi מביצים מארחות, תכנון וסינתזה של RNA דו-גדילי (dsRNA), השתלת מבחנה וטיפוח של גלמי T. dendrolimi , מיקרו-הזרקה של dsRNA, והערכה לאחר מכן של הפלת גן המטרה באמצעות ניתוח RT-qPCR. מחקר זה מספק הליך מקיף ומפורט ויזואלית לביצוע ניסויי RNAi ב- T. dendrolimi, ובכך מאפשר לחוקרים לחקור את בקרת הגנים במין זה. יתר על כן, מתודולוגיה זו ניתנת להתאמה למחקרי RNAi או מיקרו-זריקות במינים אחרים של טריכוגרמה עם התאמות קלות, מה שהופך אותה להתייחסות רבת ערך לביצוע ניסויי RNAi במינים אנדופרזיטיים אחרים.

Introduction

Trichogramma spp. הם קבוצה של טפילי ביצים שנעשה בהם שימוש נרחב כחומרי הדברה ביולוגיים יעילים ביותר נגד ספקטרום רחב של מזיקים לפידופטרנים במערכות אקולוגיות חקלאיות ויערות ברחבי העולם 1,2,3,4. היישום של טריכוגרמה בגידול המוני מספק גישה ידידותית לסביבה לניהול בר קיימא של מזיקים 5,6,7. הבנת הביולוגיה המולקולרית של צרעות טריכוגרמה מספקת תובנות חשובות לשיפור יעילות גידול המסה וביצועי השטח של חומרי הדברה ביולוגיים אלה

Protocol

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, המכשירים, התוכנה והריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. איסוף ותחזוקת תרבות חרקים

  1. הדביקו קבוצה של ~5,000 ביצים של Corcyra cephalonica (סטינטון) על כרטיס בגודל 9 ס"מ על 16 ס"מ באמצעות תמיסה של 1:5 (v/v) של אבקת גומי ערבי ומים25,26.
    הערה: הימנעו מהצמדת יותר מדי ביצי מארח לכרטיס מכיוון שהצפיפות הופכת אותו לבלתי מעשי עבור הליכי העברה ונתיחה הבאים.
  2. כדי למנוע בקיעה של ביצי מארח, יש להכפיף את כרטיסי הביצים של המארח ל-30 דקות של קרינה על-סגולה (UV) (א....

תוצאות

שיעור ההופעה של גלמי T. denrolimi שהוזרקו עם dsFerhch היה נמוך משמעותית מזה של אלה שהוזרקו עם dsGFP או אלה ללא הזרקה (טבלה 1). מבין הצרעות שהופיעו, 51.85% מצרעות T. denrolimi שהיו נתונות ל-dsFerhch פיתחו כנפיים קטנות מעוותות. הצרעות המעוותות לא נצפו בצרעות שהוזרקו להן dsGFP או ללא .......

Discussion

צרעות טריכוגרמה מוכרות כמדבירות ביולוגיות יעילות, במיוחד נגד מגוון מזיקים לפידופטרנים בחקלאות וייעור1. צרעות זעירות אלה עוברות את השלבים הלא בשלים שלהן בתוך הביצה המארחת, מאפיין המציב אתגרים בביצוע ניסויי RNAi 5,18. מחקר זה מציע מדריך חזותי מ.......

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי הפרויקטים של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32172476, 32102275), התוכנית לחדשנות במדע חקלאי וטכנולוגיה (CAAS-ZDRW202203, CAAS-ZDRW202108), וקרנות מרכזיות המנחות את פיתוח המדע והטכנולוגיה המקומי (XZ202301YD0042C).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2x ES Taq MasterMix (Dye)Cowin Biotech, ChinaCW0690HTo amplify the dsRNA sequences
20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6)Sangon Biotech, ChinaB540627-0500To dilute dsRNA
Agar stripShishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, Chinan/aTo make culture medium
Ampicillin sodiumSangon Biotech, ChinaA610028To make culture medium
Bioer Constant temperature metal bath BIOER, ChinaMB-102To synthesis dsRNA
Borosilicate glass capillary WPI, USA1B100-4To pull capillary glass needle
Clean bench Airtech, ChinaSW-CJ-1FDTo extract RNA
Double distilled waterSangon Biotech, ChinaA500197-0500To dilute cDNA
Environmental Testing chamber Panasonic, JapanMLR-352H-PCTo culture T. denrolimi
Eppendorf Centrifuge Eppendrof, Germany5418RTo store RNA content
Eppendorf FemtoJet 4iEppendrof, GermanyFemtoJet 4iTo inject T. denrolimi
Eppendorf Refrigerated Centrifuge Eppendrof, Germany5810RCentrifuge
Ethanol solution (75%, RNase-free)Aladdin, ChinaM052131-500mlTo extract RNA
Gel Extraction KitOmega, USAD25000-02To extract cDNA
GUM ArabicSolarbio, ChinaCG5991-500gTo make egg card
Isopropyl alchoholAladdin, China80109218To extract RNA
Laser-Based Micropipette Puller SUTTER, USAP-2000To pull capillary glass needle
Microloader Eppendrof, Germany20 µLTo load dsRNA
Multi-sample tissue grinder LICHEN, ChinaLC-TG-24To grind T. denrolimi
Needle Grinder SUTTER, USABV-10-ETo grind capillary glass needle
Nuclease-Free WaterSangon Biotech, ChinaTo dilute RNA
OLYMPUS MicroscopeOLYMPUS, JapanXZX16To observe T. denrolimi
PCR machine Bio-rad, USAS-1000For DNA amplification
PowerPac BasicBio-rad, USAPowerPacTM BasicTo detect the quality of dsRNA 
Primer of dsGFP (Forward)[TAATACGACTCACTATAGGG]
ACAAACCAAGGCAAGTAATA
Primer of dsGFP (Reverse)[TAATACGACTCACTATAGGG]
CAGAGGCATCTTCAACG
Primer of Ferhch for qPCR (Forward)TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT
Primer of Ferhch for qPCR (Reverse)CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT
Primer of Ferhch for RNAi (Reverse)[TAATACGACTCACTATAGGG]AG
TAGCCATCATCTTTCC
Primer of Ferhch for RNAi(Forward)[TAATACGACTCACTATAGGG]
ACACTGTCAATCGTCCTG
Primer of FoxO for qPCR (Forward)CTACGCCGATCTCATAACGC
Primer of FoxO for qPCR (Reverse)TGCTGTCGCCCTTGTCCT
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)TaKaRa, JapanRR047A
Quantitative Real-time PCR Bio-rad, USACFX 96 TouchTo perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) 
Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Toolhttps://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/
T7 RiBoMAX Express RNAi SystemPromega, USAP1700To synthesis dsRNA  in vitro 
TB Green Premix Ex TaqTM figure-materials-5268 (Til RnaseH Plus)TaKaRa, JapanRR820ATo perform RT-qPCR
TrichloromethaneKESHI, ChinaGB/T682-2002To extract RNA
TRIzol ReagentAmbion, USA15596018To extract total RNA content from samples
Ultra-low Temperature Freezer Thermo, USAForma 911

References

  1. Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status and perspectives. Annu Rev Entomol. 66, 463-484 (2020).
  2. Zhou, J. C., et al.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

201

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved