הפרעות RNA בפרזיטואיד ביצה, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Summary

המניפולציה של הפרעות RNA (RNAi) מהווה אתגר עצום במינים רבים של טפילים בעלי גודל זעיר, כגון צרעות טריכוגרמה . מחקר זה התווה שיטת RNAi יעילה ב - Trichogramma denrolimi. המתודולוגיה הנוכחית מספקת מודל חזק לחקר בקרת גנים בצרעות טריכוגרמה .

Abstract

טפילי הביצה, Trichogramma spp, מוכרים כמדבירים ביולוגיים יעילים נגד מזיקים לפידופטרנים שונים בחקלאות וביערות. השלבים הלא בוגרים של צאצאי טריכוגרמה מתפתחים בתוך הביצה המארחת, ומפגינים זעירות יוצאת דופן (כ-0.5 מ"מ אורך בוגר). מתודולוגיית RNA-interference (RNAi) התפתחה ככלי חיוני להבהרת תפקודי גנים באורגניזמים רבים. עם זאת, מניפולציה של RNAi במינים מסוימים של טפילים קטנים, כגון טריכוגרמה, הציבה בדרך כלל אתגרים משמעותיים. במחקר זה אנו מציגים שיטת RNAi יעילה ב-Trichogramma denrolimi. ההליך המתואר כולל רכישה ובידוד של דגימות בודדות של T. dendrolimi מביצים מארחות, תכנון וסינתזה של RNA דו-גדילי (dsRNA), השתלת מבחנה וטיפוח של גלמי T. dendrolimi , מיקרו-הזרקה של dsRNA, והערכה לאחר מכן של הפלת גן המטרה באמצעות ניתוח RT-qPCR. מחקר זה מספק הליך מקיף ומפורט ויזואלית לביצוע ניסויי RNAi ב- T. dendrolimi, ובכך מאפשר לחוקרים לחקור את בקרת הגנים במין זה. יתר על כן, מתודולוגיה זו ניתנת להתאמה למחקרי RNAi או מיקרו-זריקות במינים אחרים של טריכוגרמה עם התאמות קלות, מה שהופך אותה להתייחסות רבת ערך לביצוע ניסויי RNAi במינים אנדופרזיטיים אחרים.

Introduction

Trichogramma spp. הם קבוצה של טפילי ביצים שנעשה בהם שימוש נרחב כחומרי הדברה ביולוגיים יעילים ביותר נגד ספקטרום רחב של מזיקים לפידופטרנים במערכות אקולוגיות חקלאיות ויערות ברחבי העולם 1,2,3,4. היישום של טריכוגרמה בגידול המוני מספק גישה ידידותית לסביבה לניהול בר קיימא של מזיקים ^5,6,7. הבנת הביולוגיה המולקולרית של צרעות טריכוגרמה מספקת תובנות חשובות לשיפור יעילות גידול המסה וביצועי השטח של חומרי הדברה ביולוגיים אלה

Protocol

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, המכשירים, התוכנה והריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. איסוף ותחזוקת תרבות חרקים

1. הדביקו קבוצה של ~5,000 ביצים של Corcyra cephalonica (סטינטון) על כרטיס בגודל 9 ס"מ על 16 ס"מ באמצעות תמיסה של 1:5 (v/v) של אבקת גומי ערבי ומים^25,26.
   הערה: הימנעו מהצמדת יותר מדי ביצי מארח לכרטיס מכיוון שהצפיפות הופכת אותו לבלתי מעשי עבור הליכי העברה ונתיחה הבאים.
2. כדי למנוע בקיעה של ביצי מארח, יש להכפיף את כרטיסי הביצים של המארח ל-30 דקות של קרינה על-סגולה (UV) (א....

תוצאות

שיעור ההופעה של גלמי T. denrolimi שהוזרקו עם dsFerhch היה נמוך משמעותית מזה של אלה שהוזרקו עם dsGFP או אלה ללא הזרקה (טבלה 1). מבין הצרעות שהופיעו, 51.85% מצרעות T. denrolimi שהיו נתונות ל-dsFerhch פיתחו כנפיים קטנות מעוותות. הצרעות המעוותות לא נצפו בצרעות שהוזרקו להן dsGFP או ללא .......

Discussion

צרעות טריכוגרמה מוכרות כמדבירות ביולוגיות יעילות, במיוחד נגד מגוון מזיקים לפידופטרנים בחקלאות וייעור¹. צרעות זעירות אלה עוברות את השלבים הלא בשלים שלהן בתוך הביצה המארחת, מאפיין המציב אתגרים בביצוע ניסויי RNAi ^5,18. מחקר זה מציע מדריך חזותי מ.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x ES Taq MasterMix (Dye)	Cowin Biotech, China	CW0690H	To amplify the dsRNA sequences
20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6)	Sangon Biotech, China	B540627-0500	To dilute dsRNA
Agar strip	Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China	n/a	To make culture medium
Ampicillin sodium	Sangon Biotech, China	A610028	To make culture medium
Bioer Constant temperature metal bath	BIOER, China	MB-102	To synthesis dsRNA
Borosilicate glass capillary	WPI, USA	1B100-4	To pull capillary glass needle
Clean bench	Airtech, China	SW-CJ-1FD	To extract RNA
Double distilled water	Sangon Biotech, China	A500197-0500	To dilute cDNA
Environmental Testing chamber	Panasonic, Japan	MLR-352H-PC	To culture T. denrolimi
Eppendorf Centrifuge	Eppendrof, Germany	5418R	To store RNA content
Eppendorf FemtoJet 4i	Eppendrof, Germany	FemtoJet 4i	To inject T. denrolimi
Eppendorf Refrigerated Centrifuge	Eppendrof, Germany	5810R	Centrifuge
Ethanol solution (75%, RNase-free)	Aladdin, China	M052131-500ml	To extract RNA
Gel Extraction Kit	Omega, USA	D25000-02	To extract cDNA
GUM Arabic	Solarbio, China	CG5991-500g	To make egg card
Isopropyl alchohol	Aladdin, China	80109218	To extract RNA
Laser-Based Micropipette Puller	SUTTER, USA	P-2000	To pull capillary glass needle
Microloader	Eppendrof, Germany	20 µL	To load dsRNA
Multi-sample tissue grinder	LICHEN, China	LC-TG-24	To grind T. denrolimi
Needle Grinder	SUTTER, USA	BV-10-E	To grind capillary glass needle
Nuclease-Free Water	Sangon Biotech, China		To dilute RNA
OLYMPUS Microscope	OLYMPUS, Japan	XZX16	To observe T. denrolimi
PCR machine	Bio-rad, USA	S-1000	For DNA amplification
PowerPac Basic	Bio-rad, USA	PowerPacTM Basic	To detect the quality of dsRNA
Primer of dsGFP (Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA
Primer of dsGFP (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG
Primer of Ferhch for qPCR (Forward)			TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT
Primer of Ferhch for qPCR (Reverse)			CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT
Primer of Ferhch for RNAi (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC
Primer of Ferhch for RNAi(Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG
Primer of FoxO for qPCR (Forward)			CTACGCCGATCTCATAACGC
Primer of FoxO for qPCR (Reverse)			TGCTGTCGCCCTTGTCCT
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)	TaKaRa, Japan	RR047A
Quantitative Real-time PCR	Bio-rad, USA	CFX 96 Touch	To perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Tool			https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/
T7 RiBoMAX Express RNAi System	Promega, USA	P1700	To synthesis dsRNA  in vitro
TB Green Premix Ex TaqTM (Til RnaseH Plus)	TaKaRa, Japan	RR820A	To perform RT-qPCR
Trichloromethane	KESHI, China	GB/T682-2002	To extract RNA
TRIzol Reagent	Ambion, USA	15596018	To extract total RNA content from samples
Ultra-low Temperature Freezer	Thermo, USA	Forma 911