הפרעות RNA בפרזיטואיד ביצה, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Summary

המניפולציה של הפרעות RNA (RNAi) מהווה אתגר עצום במינים רבים של טפילים בעלי גודל זעיר, כגון צרעות טריכוגרמה . מחקר זה התווה שיטת RNAi יעילה ב - Trichogramma denrolimi. המתודולוגיה הנוכחית מספקת מודל חזק לחקר בקרת גנים בצרעות טריכוגרמה .

Abstract

טפילי הביצה, Trichogramma spp, מוכרים כמדבירים ביולוגיים יעילים נגד מזיקים לפידופטרנים שונים בחקלאות וביערות. השלבים הלא בוגרים של צאצאי טריכוגרמה מתפתחים בתוך הביצה המארחת, ומפגינים זעירות יוצאת דופן (כ-0.5 מ"מ אורך בוגר). מתודולוגיית RNA-interference (RNAi) התפתחה ככלי חיוני להבהרת תפקודי גנים באורגניזמים רבים. עם זאת, מניפולציה של RNAi במינים מסוימים של טפילים קטנים, כגון טריכוגרמה, הציבה בדרך כלל אתגרים משמעותיים. במחקר זה אנו מציגים שיטת RNAi יעילה ב-Trichogramma denrolimi. ההליך המתואר כולל רכישה ובידוד של דגימות בודדות של T. dendrolimi מביצים מארחות, תכנון וסינתזה של RNA דו-גדילי (dsRNA), השתלת מבחנה וטיפוח של גלמי T. dendrolimi , מיקרו-הזרקה של dsRNA, והערכה לאחר מכן של הפלת גן המטרה באמצעות ניתוח RT-qPCR. מחקר זה מספק הליך מקיף ומפורט ויזואלית לביצוע ניסויי RNAi ב- T. dendrolimi, ובכך מאפשר לחוקרים לחקור את בקרת הגנים במין זה. יתר על כן, מתודולוגיה זו ניתנת להתאמה למחקרי RNAi או מיקרו-זריקות במינים אחרים של טריכוגרמה עם התאמות קלות, מה שהופך אותה להתייחסות רבת ערך לביצוע ניסויי RNAi במינים אנדופרזיטיים אחרים.

Introduction

Trichogramma spp. הם קבוצה של טפילי ביצים שנעשה בהם שימוש נרחב כחומרי הדברה ביולוגיים יעילים ביותר נגד ספקטרום רחב של מזיקים לפידופטרנים במערכות אקולוגיות חקלאיות ויערות ברחבי העולם 1,2,3,4. היישום של טריכוגרמה בגידול המוני מספק גישה ידידותית לסביבה לניהול בר קיימא של מזיקים ^5,6,7. הבנת הביולוגיה המולקולרית של צרעות טריכוגרמה מספקת תובנות חשובות לשיפור יעילות גידול המסה וביצועי השטח של חומרי הדברה ביולוגיים אלה ^8,9 על ידי חקירת המתודולוגיה של בקרת גנים ועריכת גנום¹⁰.

מאז גילוי ההתערבות הגנטית הספציפית בתיווך RNA דו-גדילי (dsRNA) ב-Caenorhabditis elegans בשנת 1998, שיטת RNA-interference (RNAi) התפתחה לארגז כלים גנטי חיוני לחקר מנגנוני הבקרה של אורגניזמים על ידי דיכוי ביטוי של גני מטרה¹¹. ניסויי RNAi הפכו למתודולוגיה סטנדרטית המיושמת באופן נרחב לחקר תפקוד גנים במינים רבים של חרקים ^12,13. אף על פי כן, המניפולציה של RNAi מהווה אתגר עצום במינים טפיליים רבים, במיוחד בקרב אלה השייכים למשפחת הכלסידואידים האנדופרזיטיים 14,15,16. שיטת RNAi תועדה בלפחות 13 מיני טפילים 14,15,16,17,18,19. בין אלה, גישת RNAi בוצעה באופן מקיף בצרעות נסוניה והיא ישימה לאורך כל שלבי ההתפתחות, כולל עוברים, זחלים, גלמים ובוגרים 14,15,16. ראוי לציין כי צרעות נסוניה הן אקטופרזיטואידים, כאשר צאצאיהן מתפתחים בחלל הביניים בין הגלמים המארחים לבין הגולם, מה שמאפשר את גידולם במבחנה וגורם להם לסבול טיפולים מסוימים, כגון מיקרו-הזרקה. בניגוד לצרעות הנסוניה, פרטי טריכוגרמה עוברים את כל התפתחותם העוברית, הזחלית והגולמית בתוך הביצה המארחת. השכבה בשלבי העובר והזחל (העלולה לעכב חדירות dsRNA), פגיעות לנזקים, והקושי לשרוד במבחנה מהווים מכשולים אימתניים 20,21,22. בנוסף, גודלם הזעיר של פרטי טריכוגרמה, בערך ~0.5 מ"מ באורך בוגר או גולם, הופך אותם למורכבים ביותר למניפולציה של 20,21,22.

במחקר הנוכחי, אנו מתארים הליך מקיף לביצוע ניסויים בהפרעות RNA (RNAi) ב- Trichogramma denrolimi Matsumura. הליך זה כולל את ההליכים הבאים: (1) תכנון וסינתזה של RNA דו-גדילי (dsRNA), (2) מיקרו-הזרקה של גלמי T. denrolimi, (3) השתלה ודגירה חוץ גופית של גלמים אלה, ו-(4) זיהוי של הפלת גן מטרה באמצעות ניתוח RT-qPCR. גן המטרה שנבחר לניסוי ה-RNAi הוא הומולוגיה של שרשרת כבדה פריטין (Ferhch). FerHCH, חלבון קושר ברזל, מכיל מרכז פרוקסידאז שניחן ביכולות נוגדות חמצון, המקלות על חמצון Fe²⁺ עד Fe³⁺. הוא ממלא תפקיד חיוני בצמיחה והתפתחות של אורגניזמים שונים על ידי שמירה על שיווי משקל חיזור והומאוסטזיס ברזל. דלדול FerHCH יכול לגרום להצטברות יתר של ברזל, מה שמוביל לנזק בלתי הפיך לרקמות, ולעתים קרובות מגיע לשיאו בשינויים פנוטיפיים משמעותיים, כולל פגמים בגדילה, עיוותים ותמותה^23,24. מחקר זה מציע מדריך שלב אחר שלב לביצוע RNAi ב- T. denrolimi, אשר יהיה רב ערך לחקר תפקודי הגן בהקשר הרחב יותר של צרעות טריכוגרמה.

Protocol

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, המכשירים, התוכנה והריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. איסוף ותחזוקת תרבות חרקים

1. הדביקו קבוצה של ~5,000 ביצים של Corcyra cephalonica (סטינטון) על כרטיס בגודל 9 ס"מ על 16 ס"מ באמצעות תמיסה של 1:5 (v/v) של אבקת גומי ערבי ומים^25,26.
   הערה: הימנעו מהצמדת יותר מדי ביצי מארח לכרטיס מכיוון שהצפיפות הופכת אותו לבלתי מעשי עבור הליכי העברה ונתיחה הבאים.
2. כדי למנוע בקיעה של ביצי מארח, יש להכפיף את כרטיסי הביצים של המארח ל-30 דקות של קרינה על-סגולה (UV) (איור 1-i). לאחר מכן, חתכו את הנייר עם ביצים לא פעילות לכרטיסי ביצים בעובי 1 ס"מ ובקוטר 8 ס"מ, שכל אחד מהם מכיל כ-300-500 ביצים (איור 1-ii)25,26,27.
3. הכניסו קבוצה של 80-120 צרעות T. denrolimi לתוך צינור זכוכית בקוטר 2 ס"מ ובאורך 8 ס"מ. אוטמים את הצינור עם כותנה.
   הערה: שמרו על הצרעות בטמפרטורה של 25 ± 1 מעלות צלזיוס, עם מחזור אור/חושך של 16 שעות אור ו-8 שעות חושך ושמרו על לחות יחסית של כ-75%.
4. הציגו קלף ביצה מארחת לצרעות לצורך טפילות (איור 1-ii). הרשו לצרעות להפקיד את ביציהן בביצי הפונדקאי למשך 6 שעות, ולאחר מכן הוציאו מיד את הצרעות.
   הערה: הימנעו מהארכת תקופת הטפילות יתר על המידה מכיוון שהדבר עלול להוביל לצפיפות יתר של צאצאי T. denrolimi בתוך ביצה מארחת, וכתוצאה מכך לתמותת צרעות צאצאים מוגברת^28,29.

2. סינתזה של dsRNA

1. תכנון ערכות פריימר המכילות מקדם T7 לסינתזה של RNA דו-גדילי (dsRNA). בחר קטע של 300-400 bp מגן המטרה (Ferhch) לסינתזה של dsRNA.
2. לרכוש ערכות פריימר מסונתזות מסחריות לייצור dsRNA עבור הגן הממוקד ו- dsGFP לשימוש כבקרה שלילית.
3. חלץ תוכן RNA מצרעות 100 T. denrolimi באמצעות הערכה המוזכרת בהתאם לפרוטוקול^{היצרן 9}. בדוק את איכות תוכן ה- RNA; המשך אם הערך של OD260/OD280 נע בין 1.8 ל- 2.0⁹.
4. לטהר את תכולת הרנ"א עם 2 μL של 5x buffer (1 U/50 μL), 1 μL של DNAse (1 U/50 μL), ו-6.5 μL של RNA (~100 ng/μL), 0.5 μL של H₂O ב-42°C למשך 2 דקות.
5. בצע תגובת שרשרת פולימראז שעתוק לאחור (RT-PCR) כדי ליצור תבנית cDNA עם 10 μL של RNA מטוהר (~ 100 ng/μL), 4 μL של 5x buffer (1 U/50 μL), 1 μL של Enzyme Mix I (1 U/50 μL), ו- 4 μL של H₂O. בצע RT-PCR באמצעות ההגדרות הבאות: 37 ° C למשך 15 דקות, 85°C למשך 5 שניות. יש לאחסן את מוצר ה-cDNA בטמפרטורה של -4°C עד לשימוש.
6. בצע תגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי להגביר את רצפי ה-dsRNA בהתאם לתערובת האב הנזכרת (10 μL של Taq II [1 U/50 μL], 0.8 μL של פריימר קדמי [0.4 μM], 0.8 μL של פריימר הפוך [0.4 μM], 0.8 μL של תבנית DNA [40 ng/μL], ו-7.6 μL של H₂O). בצע PCR באמצעות ההגדרות הבאות: 94 °C למשך 2 דקות; 35 מחזורים עם 94 ° C עבור 30 שניות, 60 ° C עבור 30 שניות, 72 ° C עבור 30; 72°C למשך 2 דקות.
7. להעריך את האיכות של מוצרי PCR על ידי אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז 2.0% ^5,9 ולאשר את רצף המטרה באמצעות ריצוף Sanger.
8. יש לטהר את מוצר ה-PCR באמצעות ערכת מיצוי הג'ל בהתאם להנחיות היצרן ^9,23.
9. השתמש במערכת RNAi כדי לסנתז dsRNA עבור גן המטרה עם 10 μL של 2x buffer (0.02 U/μL), 8 μL של תבנית DNA (75 ng/μL), ו 2 μL של תערובת אנזימים (1 U/50 μL) עם ההגדרות הבאות: 37 ° C במשך 30 דקות, 70 ° C במשך 10 דקות, ו 25 ° C במשך 20 דקות. הצהירו את ה-dsRNA המסונתז עם 30 מיקרוליטר של מים נטולי Nuclease.
10. הערך את האיכות של מוצר dsRNA על ידי הדמיה על 1.0% agarose ג'ל ^5,9. לדלל את ה-dsRNA ל-7,000 ננוגרם/מיקרוליטר. בדוק את איכות מוצר ה-dsRNA; המשך אם הערך של OD260/OD280 נע בין 1.8 ל- 2.0⁹. יש לאחסן את מוצר ה-dsRNA בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.

3. השתלת גלמים T. denrolimi

1. טפחו את ביצי המאכסן הטפיליות במשך כ-8 ימים בטמפרטורה של 25 ± 1°C, תוך שמירה על מחזור אור של 16 שעות / 8 שעות חושך ולחות יחסית של ~75%. ביצי הפונדקאי הטפיליות יושחרו לאחר 5 ימים³⁰ (איור 1-iv,v).
2. מעבירים את כרטיס הביצית המארחת למיקרוסקופ מנתח. השתמשו בזוג מחטי טונגסטן (איור 1-vi) כדי להסיר בקפדנות את הכוריון מביצי הפונדקאי (איור 1-vii) ולשלוף את הגלמים מבפנים (איור 1-viii)^5,17,18.
   הערה: קצה מחט הניתוח צריך להיות פחות מ 0.05 מ"מ.
3. מכינים צלחת נקייה למצע. שפכו החוצה 10-15 מ"ל של תמיסת אגר בנפח 15 גרם/ליטר, ואפשרו לה להתקרר באופן טבעי (איור 2-i).
   הערה: ערבבו את תמיסת האגר עם 0.5 גרם סטרפטומיצין כדי לעכב את צמיחת המזהמים במבחנה.
4. השתמשו בקבר שעבר חיטוי כדי לחרוט מספר חריצים בעומק 0.2-0.3 מ"מ וברוחב 0.4-0.8 מ"מ (איור 2-ii).
5. השתמשו במברשת קטנה (איור 2-iii) כדי להשתיל גולם מביצת הפונדקאי שנותחה לאחד החריצים במצע האגר (איור 2-iv).
6. חזרו על שלבים 3.4 ו-3.5, והשתילו 100-300 גלמים בנפרד לתוך החריצים בזה אחר זה (איור 2-v).

4. הזרקה זעירה של dsRNA לתוך T. denrolimi pupa

1. השתמשו במושך מחטי זכוכית כדי למשוך נימי זכוכית (איור 3-i,ii). הגדירו את החום ל-280, את המהירות ל-170, את ההשהיה ל-250 ואת המשיכה ל-30 במושך מחטים (איור 3-iii). הכינו מחטי זכוכית נימיות מרובות למיקרו-הזרקה (איור 3-iv,v).
2. שיקוע קצה מחט הזכוכית באמצעות צלחת שוחקת (איור 3-vi).
   הערה: ודא שקצה מחט ההזרקה נשאר חד; אחרת, זה עלול לגרום לתמותת גולמים או לעכב זרימת מגיבים דרך המחט (איור 3-vii).
3. טען כ-2 μL של תמיסת הזרקת dsRNA עם 7,000 ng/μL לתוך מחט ההזרקה המוכנה באמצעות משאבת מיקרו-הזרקה (איור 3-vii).
4. העבירו את מצע האגר המכיל מאות גלמים על משטח של מיקרוסקופ מורכב (איור 3-viii).
5. הכניסו בזהירות את מחט ההזרקה לבטן של גולם T. denrolimi בזווית ~30° לבטן מתחת לעדשה (איור 3-ix).
6. הזריקו בהדרגה ~5 nL של תמיסת ההזרקה (שלב 4.3) לתוך גולם T. denrolimi בעדינות ככל האפשר.
   הערה: גולם T. denrolimi עשוי להתנפח מעט כאשר תמיסת dsRNA מוזרקת. הזרקת כמות מוגזמת של תמיסה לגלמים או שימוש במחטים עם פתחים גדולים מדי עלולים לגרום למוות מוקדם של הגולם. החליפו את המחטים כאשר הן נסתמות לאחר הזרקת מספר עד עשרות גלמים.
7. חזור על שלבים 4.5 ו -4.6, הזרקת dsRNA לתוך 600 גלמים אחד אחד.
   הערה: לניתוח RT-qPCR אמין, יש לבודד את תכולת הרנ"א מלפחות 100 גלמים. הזריקו לפחות 600 גלמים עבור שלושה עותקים משוכפלים בטיפול dsRNA ושלושה משוכפלים בבקרה השלילית dsGFP ⁹.

5. דגירה של T. denrolimi pupae

1. העבר את המצע המכיל גלמים מוזרקים לאינקובטור ב 25 ± 1 ° C עם מחזור אור / כהה 16 שעות / 8 שעות ו ~ 75% RH.
2. יש לדגור על כ-700 גלמים מסוג T. denrolimi לכל טיפול למשך 24 שעות או 48 שעות. חלץ תוכן RNA מקבוצה של 100 גלמים לכל שכפול⁹.
   הערה: הסר את הגלמים המכווצים (הגלמים המתים) מהדגימות; אחרת, זה עלול לגרום לטעויות בזיהוי ביטוי גנים.
3. לדגור ~50 T. denrolimi גלמים בכל טיפול עד שהצרעות מגיחות (איור 3-x). רשום את שיעור ההופעה ואת שיעור העיוות.

6. איתור ביטוי גנים ממוקד

1. עצבו את ערכת הפריימר עבור גן היעד ואת גני הייחוס עבור RT-qPCR באמצעות כלי עיצוב.
   הערה: ודא שהרצפים של הפריימרים RT-qPCR אינם חופפים לאזור היעד של dsRNA.
2. השתמש בתיבת מזלג הגן O (FoxO) כגן הייחוס בניתוח RT-qPCR; הפריימרים של FoxO דווחו בעבר⁹.
3. השג ערכות פריימר מסונתזות מסחריות. בצע RT-qPCR עם 10 μL של Taq II (1 U/50 μL), 0.8 μL של פריימר קדמי (0.4 μM), 0.8 μL של פריימר הפוך (0.4 μM), 0.8 μL של תבנית (10 ng/μL) ו- 7.6 μL של H₂O. בצע RT-qPCR באמצעות ההגדרות הבאות: 95 ° C עבור 30 שניות; 35 מחזורים עם 95 ° C עבור 5 שניות, 57 ° C עבור 30 שניות, 72 ° C עבור 30; 95 °C עבור 10 שניות; 60°C עבור 5 שניות, ו- 95°C עבור 5 שניות.
4. חשב את ערך הביטוי של גן היעד באמצעות שיטת ^{2-ΔΔCt 9,25}.
5. להשתמש במבחן Kruskal-Wallis כדי לנתח את הביטוי של גן המטרה תחת השפעת טיפולים שונים (dsFerhch, dsGFP, ללא הזרקה).
   הערה: הימנע משימוש במבחנים פרמטריים (למשל, מבחן t) להשוואות פוסט-הוק מכיוון שההטרוסקדסטיות וחוסר הנורמליות של הנתונים עלולים להוביל למסקנות שגויות²⁵.

תוצאות

שיעור ההופעה של גלמי T. denrolimi שהוזרקו עם dsFerhch היה נמוך משמעותית מזה של אלה שהוזרקו עם dsGFP או אלה ללא הזרקה (טבלה 1). מבין הצרעות שהופיעו, 51.85% מצרעות T. denrolimi שהיו נתונות ל-dsFerhch פיתחו כנפיים קטנות מעוותות. הצרעות המעוותות לא נצפו בצרעות שהוזרקו להן dsGFP או ללא ...

Discussion

צרעות טריכוגרמה מוכרות כמדבירות ביולוגיות יעילות, במיוחד נגד מגוון מזיקים לפידופטרנים בחקלאות וייעור¹. צרעות זעירות אלה עוברות את השלבים הלא בשלים שלהן בתוך הביצה המארחת, מאפיין המציב אתגרים בביצוע ניסויי RNAi ^5,18. מחקר זה מציע מדריך חזותי מ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x ES Taq MasterMix (Dye)	Cowin Biotech, China	CW0690H	To amplify the dsRNA sequences
20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6)	Sangon Biotech, China	B540627-0500	To dilute dsRNA
Agar strip	Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China	n/a	To make culture medium
Ampicillin sodium	Sangon Biotech, China	A610028	To make culture medium
Bioer Constant temperature metal bath	BIOER, China	MB-102	To synthesis dsRNA
Borosilicate glass capillary	WPI, USA	1B100-4	To pull capillary glass needle
Clean bench	Airtech, China	SW-CJ-1FD	To extract RNA
Double distilled water	Sangon Biotech, China	A500197-0500	To dilute cDNA
Environmental Testing chamber	Panasonic, Japan	MLR-352H-PC	To culture T. denrolimi
Eppendorf Centrifuge	Eppendrof, Germany	5418R	To store RNA content
Eppendorf FemtoJet 4i	Eppendrof, Germany	FemtoJet 4i	To inject T. denrolimi
Eppendorf Refrigerated Centrifuge	Eppendrof, Germany	5810R	Centrifuge
Ethanol solution (75%, RNase-free)	Aladdin, China	M052131-500ml	To extract RNA
Gel Extraction Kit	Omega, USA	D25000-02	To extract cDNA
GUM Arabic	Solarbio, China	CG5991-500g	To make egg card
Isopropyl alchohol	Aladdin, China	80109218	To extract RNA
Laser-Based Micropipette Puller	SUTTER, USA	P-2000	To pull capillary glass needle
Microloader	Eppendrof, Germany	20 µL	To load dsRNA
Multi-sample tissue grinder	LICHEN, China	LC-TG-24	To grind T. denrolimi
Needle Grinder	SUTTER, USA	BV-10-E	To grind capillary glass needle
Nuclease-Free Water	Sangon Biotech, China		To dilute RNA
OLYMPUS Microscope	OLYMPUS, Japan	XZX16	To observe T. denrolimi
PCR machine	Bio-rad, USA	S-1000	For DNA amplification
PowerPac Basic	Bio-rad, USA	PowerPacTM Basic	To detect the quality of dsRNA
Primer of dsGFP (Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA
Primer of dsGFP (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG
Primer of Ferhch for qPCR (Forward)			TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT
Primer of Ferhch for qPCR (Reverse)			CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT
Primer of Ferhch for RNAi (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC
Primer of Ferhch for RNAi(Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG
Primer of FoxO for qPCR (Forward)			CTACGCCGATCTCATAACGC
Primer of FoxO for qPCR (Reverse)			TGCTGTCGCCCTTGTCCT
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)	TaKaRa, Japan	RR047A
Quantitative Real-time PCR	Bio-rad, USA	CFX 96 Touch	To perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Tool			https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/
T7 RiBoMAX Express RNAi System	Promega, USA	P1700	To synthesis dsRNA  in vitro
TB Green Premix Ex TaqTM (Til RnaseH Plus)	TaKaRa, Japan	RR820A	To perform RT-qPCR
Trichloromethane	KESHI, China	GB/T682-2002	To extract RNA
TRIzol Reagent	Ambion, USA	15596018	To extract total RNA content from samples
Ultra-low Temperature Freezer	Thermo, USA	Forma 911