A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
המניפולציה של הפרעות RNA (RNAi) מהווה אתגר עצום במינים רבים של טפילים בעלי גודל זעיר, כגון צרעות טריכוגרמה . מחקר זה התווה שיטת RNAi יעילה ב - Trichogramma denrolimi. המתודולוגיה הנוכחית מספקת מודל חזק לחקר בקרת גנים בצרעות טריכוגרמה .
טפילי הביצה, Trichogramma spp, מוכרים כמדבירים ביולוגיים יעילים נגד מזיקים לפידופטרנים שונים בחקלאות וביערות. השלבים הלא בוגרים של צאצאי טריכוגרמה מתפתחים בתוך הביצה המארחת, ומפגינים זעירות יוצאת דופן (כ-0.5 מ"מ אורך בוגר). מתודולוגיית RNA-interference (RNAi) התפתחה ככלי חיוני להבהרת תפקודי גנים באורגניזמים רבים. עם זאת, מניפולציה של RNAi במינים מסוימים של טפילים קטנים, כגון טריכוגרמה, הציבה בדרך כלל אתגרים משמעותיים. במחקר זה אנו מציגים שיטת RNAi יעילה ב-Trichogramma denrolimi. ההליך המתואר כולל רכישה ובידוד של דגימות בודדות של T. dendrolimi מביצים מארחות, תכנון וסינתזה של RNA דו-גדילי (dsRNA), השתלת מבחנה וטיפוח של גלמי T. dendrolimi , מיקרו-הזרקה של dsRNA, והערכה לאחר מכן של הפלת גן המטרה באמצעות ניתוח RT-qPCR. מחקר זה מספק הליך מקיף ומפורט ויזואלית לביצוע ניסויי RNAi ב- T. dendrolimi, ובכך מאפשר לחוקרים לחקור את בקרת הגנים במין זה. יתר על כן, מתודולוגיה זו ניתנת להתאמה למחקרי RNAi או מיקרו-זריקות במינים אחרים של טריכוגרמה עם התאמות קלות, מה שהופך אותה להתייחסות רבת ערך לביצוע ניסויי RNAi במינים אנדופרזיטיים אחרים.
Trichogramma spp. הם קבוצה של טפילי ביצים שנעשה בהם שימוש נרחב כחומרי הדברה ביולוגיים יעילים ביותר נגד ספקטרום רחב של מזיקים לפידופטרנים במערכות אקולוגיות חקלאיות ויערות ברחבי העולם 1,2,3,4. היישום של טריכוגרמה בגידול המוני מספק גישה ידידותית לסביבה לניהול בר קיימא של מזיקים 5,6,7. הבנת הביולוגיה המולקולרית של צרעות טריכוגרמה מספקת תובנות חשובות לשיפור יעילות גידול המסה וביצועי השטח של חומרי הדברה ביולוגיים אלה
הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, המכשירים, התוכנה והריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה.
1. איסוף ותחזוקת תרבות חרקים
שיעור ההופעה של גלמי T. denrolimi שהוזרקו עם dsFerhch היה נמוך משמעותית מזה של אלה שהוזרקו עם dsGFP או אלה ללא הזרקה (טבלה 1). מבין הצרעות שהופיעו, 51.85% מצרעות T. denrolimi שהיו נתונות ל-dsFerhch פיתחו כנפיים קטנות מעוותות. הצרעות המעוותות לא נצפו בצרעות שהוזרקו להן dsGFP או ללא .......
צרעות טריכוגרמה מוכרות כמדבירות ביולוגיות יעילות, במיוחד נגד מגוון מזיקים לפידופטרנים בחקלאות וייעור1. צרעות זעירות אלה עוברות את השלבים הלא בשלים שלהן בתוך הביצה המארחת, מאפיין המציב אתגרים בביצוע ניסויי RNAi 5,18. מחקר זה מציע מדריך חזותי מ.......
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.
מחקר זה מומן על ידי הפרויקטים של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32172476, 32102275), התוכנית לחדשנות במדע חקלאי וטכנולוגיה (CAAS-ZDRW202203, CAAS-ZDRW202108), וקרנות מרכזיות המנחות את פיתוח המדע והטכנולוגיה המקומי (XZ202301YD0042C).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
2x ES Taq MasterMix (Dye) | Cowin Biotech, China | CW0690H | To amplify the dsRNA sequences |
20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6) | Sangon Biotech, China | B540627-0500 | To dilute dsRNA |
Agar strip | Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China | n/a | To make culture medium |
Ampicillin sodium | Sangon Biotech, China | A610028 | To make culture medium |
Bioer Constant temperature metal bath | BIOER, China | MB-102 | To synthesis dsRNA |
Borosilicate glass capillary | WPI, USA | 1B100-4 | To pull capillary glass needle |
Clean bench | Airtech, China | SW-CJ-1FD | To extract RNA |
Double distilled water | Sangon Biotech, China | A500197-0500 | To dilute cDNA |
Environmental Testing chamber | Panasonic, Japan | MLR-352H-PC | To culture T. denrolimi |
Eppendorf Centrifuge | Eppendrof, Germany | 5418R | To store RNA content |
Eppendorf FemtoJet 4i | Eppendrof, Germany | FemtoJet 4i | To inject T. denrolimi |
Eppendorf Refrigerated Centrifuge | Eppendrof, Germany | 5810R | Centrifuge |
Ethanol solution (75%, RNase-free) | Aladdin, China | M052131-500ml | To extract RNA |
Gel Extraction Kit | Omega, USA | D25000-02 | To extract cDNA |
GUM Arabic | Solarbio, China | CG5991-500g | To make egg card |
Isopropyl alchohol | Aladdin, China | 80109218 | To extract RNA |
Laser-Based Micropipette Puller | SUTTER, USA | P-2000 | To pull capillary glass needle |
Microloader | Eppendrof, Germany | 20 µL | To load dsRNA |
Multi-sample tissue grinder | LICHEN, China | LC-TG-24 | To grind T. denrolimi |
Needle Grinder | SUTTER, USA | BV-10-E | To grind capillary glass needle |
Nuclease-Free Water | Sangon Biotech, China | To dilute RNA | |
OLYMPUS Microscope | OLYMPUS, Japan | XZX16 | To observe T. denrolimi |
PCR machine | Bio-rad, USA | S-1000 | For DNA amplification |
PowerPac Basic | Bio-rad, USA | PowerPacTM Basic | To detect the quality of dsRNA |
Primer of dsGFP (Forward) | [TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA | ||
Primer of dsGFP (Reverse) | [TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG | ||
Primer of Ferhch for qPCR (Forward) | TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT | ||
Primer of Ferhch for qPCR (Reverse) | CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT | ||
Primer of Ferhch for RNAi (Reverse) | [TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC | ||
Primer of Ferhch for RNAi(Forward) | [TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG | ||
Primer of FoxO for qPCR (Forward) | CTACGCCGATCTCATAACGC | ||
Primer of FoxO for qPCR (Reverse) | TGCTGTCGCCCTTGTCCT | ||
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) | TaKaRa, Japan | RR047A | |
Quantitative Real-time PCR | Bio-rad, USA | CFX 96 Touch | To perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) |
Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Tool | https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/ | ||
T7 RiBoMAX Express RNAi System | Promega, USA | P1700 | To synthesis dsRNA in vitro |
TB Green Premix Ex TaqTM ![]() | TaKaRa, Japan | RR820A | To perform RT-qPCR |
Trichloromethane | KESHI, China | GB/T682-2002 | To extract RNA |
TRIzol Reagent | Ambion, USA | 15596018 | To extract total RNA content from samples |
Ultra-low Temperature Freezer | Thermo, USA | Forma 911 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved