Interferência de RNA no parasitoide de ovos, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Resumo

A manipulação de RNA de interferência (RNAi) apresenta um formidável desafio em muitas espécies de parasitoides com tamanho diminuto, como as vespas Trichogramma . Este estudo delineou um método RNAi eficiente em Trichogramma denrolimi. A presente metodologia fornece um modelo robusto para investigar a regulação gênica em vespas Trichogramma .

Resumo

Os parasitoides de ovos, Trichogramma spp, são reconhecidos como eficientes agentes de controle biológico contra diversas pragas de lepidópteros na agricultura e florestas. Os estágios imaturos da prole de Trichogramma desenvolvem-se dentro do ovo hospedeiro, exibindo notável diminuividade (aproximadamente 0,5 mm de comprimento adulto). A metodologia de RNA-interferência (RNAi) tem emergido como uma ferramenta crucial para elucidar funções gênicas em inúmeros organismos. No entanto, a manipulação de RNAi em certas espécies de pequenos parasitoides, como Trichogramma, tem geralmente representado desafios significativos. Neste estudo, apresentamos um método RNAi eficiente em Trichogramma denrolimi. O procedimento delineado abrange a aquisição e o isolamento de espécimes individuais de T. dendrolimi a partir de ovos hospedeiros, o planejamento e a síntese de RNA de fita dupla (dsRNA), o transplante e cultivo in vitro de pupas de T. dendrolimi , a microinjeção de dsRNA e a subsequente avaliação do knockdown do gene alvo através da análise de RT-qPCR. Este estudo fornece um procedimento abrangente e visualmente detalhado para a realização de experimentos de RNAi em T. dendrolimi, permitindo que os pesquisadores investiguem a regulação gênica nesta espécie. Além disso, esta metodologia é adaptável para estudos de RNAi ou micro-injeções em outras espécies de Trichogramma com pequenos ajustes, tornando-se uma referência valiosa para a realização de experimentos de RNAi em outras espécies endoparasitárias.

Introdução

Trichogramma spp é um grupo de parasitoides de ovos que tem sido extensivamente utilizado como agentes de controle biológico altamente eficientes contra um amplo espectro de lepidópteros pragas em ecossistemas agrícolas e florestais em todo o mundo 1,2,3,4. A aplicação de Trichogramma criado em massa proporciona uma abordagem ambientalmente correta para o manejo sustentável de pragas ^5,6,7. A compreensão da biologia molecular de vespas Trichogramma fornece informações valiosas para aumentar a eficiência de criação em massa e o desempenho em campo desses agentes de controle biológico ^8,9, investigando a metodologia de regulação gênica e edição do genoma¹⁰.

Desde a descoberta da interferência genética específica mediada por RNA de fita dupla (dsRNA) em Caenorhabditis elegans em 1998, o método de interferência de RNA (RNAi) evoluiu para um kit de ferramentas genético vital para explorar os mecanismos regulatórios de organismos suprimindo a expressão de genes-alvo¹¹. Experimentos com RNAi tornaram-se uma metodologia padrão amplamente aplicada para estudar a função gênica em inúmeras espécies de insetos^12,13. No entanto, a manipulação de RNAi representa um formidável desafio em muitas espécies de parasitoides, particularmente naquelas pertencentes à família endoparasitária Chalcidoidea14,15,16. O método RNAi foi documentado em pelo menos 13 espécies de parasitoides 14,15,16,17,18,19. Dentre estas, a abordagem RNAi tem sido amplamente conduzida em vespas Nasonia e é aplicável em todos os estágios de desenvolvimento, incluindo embriões, larvas, pupas e adultos 14,15,16. Vale ressaltar que as vespas Nasonia são ectoparasitóides, com seus filhotes se desenvolvendo no espaço intersticial entre a pupa hospedeira e o pupário, possibilitando seu cultivo in vitro e fazendo-os tolerar certos tratamentos, como a microinjeção. Ao contrário das vespas Nasonia, os indivíduos de Trichogramma passam por todo o seu desenvolvimento embrionário, larval e pupal dentro do ovo hospedeiro. A camada nos estágios embrionário e larval (que pode impedir a permeabilidade ao dsRNA), a vulnerabilidade a danos e a dificuldade de sobrevivência in vitro apresentam obstáculos formidáveis 20,21,22. Além disso, o tamanho diminuto dos indivíduos de Trichogramma, aproximadamente ~0,5 mm no comprimento adulto ou pupal, torna-os extremamente intrincados para manipular20,21,22.

No presente estudo, delineamos um procedimento abrangente para a realização de experimentos de RNA de interferência (RNAi) em Trichogramma denrolimi Matsumura. Esse procedimento engloba os seguintes procedimentos: (1) o planejamento e síntese de RNA de fita dupla (dsRNA), (2) microinjeção de pupas de T. denrolimi, (3) o transplante e incubação in vitro dessas pupas e (4) a detecção de knockdown do gene alvo por meio da análise de RT-qPCR. O gene alvo selecionado para o experimento RNAi é a homologia da cadeia pesada de ferritina (Ferhch). FerHCH, uma proteína ligadora de ferro, contém um centro de ferroxidase dotado de capacidades antioxidantes, facilitando a oxidação de Fe²⁺ a Fe³⁺. Desempenha um papel indispensável no crescimento e desenvolvimento de vários organismos, mantendo o equilíbrio redox e a homeostase do ferro. A depleção de FerHCH pode resultar no acúmulo excessivo de ferro, levando a danos teciduais irreversíveis e, muitas vezes, culminando em alterações fenotípicas significativas, incluindo defeitos de crescimento, deformidades e mortalidade^23,24. Este estudo oferece um guia passo-a-passo para a condução de RNAi em T. denrolimi, que será inestimável para investigar as funções gênicas dentro do contexto mais amplo de vespas Trichogramma.

Protocolo

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, instrumentos, software e reagentes usados neste protocolo.

1. Coleta e manutenção da cultura de insetos

1. Aderir um grupo de ~5.000 ovos de Corcyra cephalonica (Stainton) em um cartão de 9 cm por 16 cm usando uma solução 1:5 (v/v) de goma arábica em pó e água^25,26.
   NOTA: Evite anexar muitos ovos de anfitrião ao cartão, pois a superlotação torna impraticável para procedimentos subsequentes de transferência e dissecação.
2. Para evitar a eclosão dos ovos do hospedeiro, sujeitar os cartões de ovos do hospedeiro a 30 min de irradiação ultravioleta (UV) (Figura 1-i). Em seguida, corte o papel com ovos inativados em cartões de ovos medindo 1 cm de espessura e 8 cm de diâmetro, cada um contendo aproximadamente 300-500 ovos (Figura 1-ii)25,26,27.
3. Introduzir uma coorte de 80-120 vespas T. denrolimi em um tubo de vidro medindo 2 cm de diâmetro e 8 cm de comprimento. Sele o tubo com algodão.
   NOTA: Manter as vespas a uma temperatura de 25 ± 1 °C, com um ciclo claro/escuro de 16 h de luz e 8 h de escuridão e manter uma umidade relativa de aproximadamente 75%.
4. Apresentar um cartão de ovo hospedeiro às vespas para parasitização (Figura 1-ii). Permita que as vespas depositem seus ovos nos ovos hospedeiros por 6 h, após o que imediatamente remover as vespas.
   NOTA: Evitar prolongar excessivamente o período de parasitização, pois isso pode levar à superlotação da prole de T. denrolimi dentro de um ovo hospedeiro, resultando em aumento da mortalidade da vespa da prole^28,29.

2. Síntese de dsRNA

1. Projetar conjuntos de primers contendo um promotor T7 para a síntese de RNA de fita dupla (dsRNA). Escolha um segmento de 300-400 pb do gene alvo (Ferhch) para a síntese de dsRNA.
2. Adquirir conjuntos de primers sintetizados comercialmente para a produção de dsRNA para o gene alvo e dsGFP para uso como controle negativo.
3. Extrair o conteúdo de RNA de 100 vespas T. denrolimi usando o kit referenciado seguindo o protocolo do fabricante⁹. Verificar a qualidade do conteúdo de RNA; prossiga se o valor de OD260/OD280 variar de 1,8 a 2,0⁹.
4. Purificar o conteúdo de RNA com 2 μL de tampão 5x (1 U/50 μL), 1 μL de DNAse (1 U/50 μL) e 6,5 μL de RNA (~100 ng/μL), 0,5 μL de H₂O a 42 °C por 2 min.
5. Realizar reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR) para gerar um molde de cDNA com 10 μL de RNA purificado (~100 ng/μL), 4 μL de tampão 5x (1 U/50 μL), 1 μL de Enzyme Mix I (1 U/50 μL) e 4 μL de H₂O. Realize RT-PCR usando as seguintes configurações: 37 °C durante 15 min, 85 °C por 5 s. Conservar o produto de cDNA a -4 °C até à utilização.
6. Realizar reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar as sequências de dsRNA de acordo com a mistura mestre referenciada (10 μL de Taq II [1 U/50 μL], 0,8 μL de primer forward [0,4 μM], 0,8 μL de primer reverso [0,4 μM], 0,8 μL de molde de DNA [40 ng/μL] e 7,6 μL de H₂O). Realizar PCR usando as seguintes configurações: 94 °C por 2 min; 35 ciclos com 94 °C por 30 s, 60 °C por 30 s, 72 °C por 30; 72 °C por 2 min.
7. Avaliar a qualidade dos produtos de PCR por eletroforese em gel de agarose a 2,0% ^5,9 e confirmar a sequência alvo através do sequenciamento de Sanger.
8. Purificar o produto da PCR utilizando o Kit de Extração em Gel conforme orientação do fabricante ^9,23.
9. Utilizar um sistema RNAi para sintetizar dsRNA para o gene alvo com 10 μL de tampão 2x (0,02 U/μL), 8 μL de molde de DNA (75 ng/μL) e 2 μL de mistura enzimática (1 U/50 μL) com as seguintes configurações: 37 °C por 30 min, 70 °C por 10 min e 25 °C por 20 min. Eluir o dsRNA sintetizado com 30 μL de Água Livre de Nuclease.
10. Avaliar a qualidade do produto de dsRNA visualizando-o em gel de agarose a 1,0% ^5,9. Diluir o dsRNA para 7.000 ng/μL. Verificar a qualidade do produto dsRNA; prossiga se o valor de OD260/OD280 variar de 1,8 a 2,0⁹. Conservar o produto dsRNA a -20 °C até à utilização.

3. Transplante de pupas de T. denrolimi

1. Cultivar os ovos do hospedeiro parasitado por aproximadamente 8 dias a 25 ± 1°C, mantendo um ciclo claro/8 h escuro de 16 h e umidade relativa de ~75%. Os ovos do hospedeiro parasitado escurecerão após^{5 dias 30} (Figura 1-iv,v).
2. Transfira o cartão do ovo hospedeiro para um microscópio dissecante. Empregar um par de agulhas de tungstênio (Figura 1-vi) para remover meticulosamente o córion dos ovos hospedeiros (Figura 1-vii) e recuperar a pupa de dentro (Figura 1-viii)^5,17,18.
   NOTA: A ponta da agulha dissecante deve ser inferior a 0,05 mm.
3. Prepare uma placa limpa para o substrato. Despejar 10-15 mL de uma solução de ágar 15 g/L, permitindo esfriar naturalmente (Figura 2-i).
   NOTA: Misturar a solução de ágar com 0,5 g de estreptomicina para inibir o crescimento de contaminantes in vitro.
4. Empregar um gravador desinfetado para condicionar vários sulcos medindo 0,2-0,3 mm de profundidade e 0,4-0,8 mm de largura (Figura 2-ii).
5. Utilizar uma pequena escova (Figura 2-iii) para transplantar uma pupa do ovo hospedeiro dissecado para um dos sulcos do substrato ágar (Figura 2-iv).
6. Repetir os passos 3.4 e 3.5, transplantando 100-300 pupas individualmente nos sulcos, uma a uma (Figura 2-v).

4. Micro-injeção de dsRNA em T. denrolimi pupa

1. Utilizar extrator com agulha de vidro para tracionar capilar de vidro (Figura 3-i,ii). Ajuste o Heat para 280, o Velocity para 170, o Delay para 250 e o Pull para 30 em um extrator de agulha (Figura 3-iii). Preparar múltiplas agulhas de vidro capilar para microinjeção (Figura 3-iv,v).
2. Biselar a ponta da agulha de vidro com placa abrasiva (Figura 3-vi).
   NOTA: Certifique-se de que a ponta da agulha de injeção permanece afiada; caso contrário, pode resultar em mortalidade pupal ou impedir o fluxo de reagentes através da agulha (Figura 3-vii).
3. Carregar aproximadamente 2 μL da solução de injeção de dsRNA com 7.000 ng/μL na agulha de injeção preparada usando uma microbomba de injeção (Figura 3-vii).
4. Transfira o substrato de ágar contendo centenas de pupas para a plataforma de um microscópio composto (Figura 3-viii).
5. Insira cuidadosamente a agulha de injeção no abdome de uma pupa de T. denrolimi em um ângulo de ~30° em relação ao abdome sob a lente (Figura 3-ix).
6. Injetar gradualmente ~5 nL da solução de injeção (passo 4.3) na pupa de T. denrolimi o mais suavemente possível.
   NOTA: A pupa de T. denrolimi pode inchar ligeiramente à medida que a solução de dsRNA é injetada. Injetar uma quantidade excessiva de solução na pupa ou usar agulhas com aberturas excessivamente grandes pode resultar em morte prematura da pupa. Troque as agulhas quando ficarem entupidas depois de injetar várias a dezenas de pupas.
7. Repita as etapas 4.5 e 4.6, injetando dsRNA em 600 pupas uma a uma.
   NOTA: Para uma análise confiável de RT-qPCR, o conteúdo de RNA deve ser isolado de pelo menos 100 pupas. Injetar pelo menos 600 pupas para três repetições no tratamento com dsRNA e três repetições no controle negativo para dsGFP ⁹.

5. Incubação de pupas de T. denrolimi

1. Transfira o substrato contendo pupas injetadas para uma incubadora a 25 ± 1 °C com um ciclo claro/escuro de 16 h/8 h e ~75% UR.
2. Incubar aproximadamente 700 pupas de T. denrolimi por tratamento durante 24 h ou 48 h. Extrair o conteúdo de RNA de um grupo de 100 pupas por réplica⁹.
   OBS: Retirar as pupas encolhidas (pupas mortas) das amostras; caso contrário, pode resultar em erros na detecção da expressão gênica.
3. Incubar ~50 pupas de T. denrolimi por tratamento até que as vespas surjam (Figura 3-x). Registre a taxa de emergência e a taxa de deformidade.

6. Detecção da expressão gênica direcionada

1. Projete o conjunto de primers para o gene alvo e genes de referência para RT-qPCR usando uma ferramenta de design.
   NOTA: Certifique-se de que as sequências dos primers RT-qPCR não se sobreponham à região alvo do dsRNA.
2. Empregar o gene forkhead box O (FoxO) como gene de referência na análise de RT-qPCR; os primers de FoxO foram relatados anteriormente⁹.
3. Obter conjuntos de primers sintetizados comercialmente. Realizar RT-qPCR com 10 μL de Taq II (1 U/50 μL), 0,8 μL de primer forward (0,4 μM), 0,8 μL de primer reverso (0,4 μM), 0,8 μL de template (10 ng/μL) e 7,6 μL de H₂O. Realizar RT-qPCR usando as seguintes configurações: 95 °C por 30 s; 35 ciclos com 95 °C por 5 s, 57 °C por 30 s, 72 °C por 30; 95 °C por 10 s; 60 °C por 5 s e 95 °C por 5 s.
4. Calcular o valor de expressão do gene alvo utilizando o método ^{2-ΔΔCt 9,25}.
5. Empregar o teste de Kruskal-Wallis para analisar a expressão do gene alvo sob a influência de diferentes tratamentos (dsFerhch, dsGFP, não injeção).
   NOTA: Evite o uso de testes paramétricos (por exemplo, teste t) para comparações post-hoc, pois a heterocedasticidade e a não normalidade dos dados podem levar a conclusões errôneas²⁵.

Resultados

A taxa de emergência de pupas de T. denrolimi injetadas com dsFerhch foi significativamente menor do que a daquelas injetadas com dsGFP ou sem injeção (Tabela 1). Entre as vespas emergidas, 51,85% das vespas T. denrolimi submetidas a dsFerhch desenvolveram pequenas asas deformadas. As vespas deformadas não foram observadas nas vespas injetadas com dsGFP ou sem qualquer injeção (Tabela 1). Além disso, o abdome de pupas de T....

Discussão

As vespas Trichogramma são reconhecidas como agentes eficazes de controle biológico, visando especificamente uma variedade de pragas de lepidópteros na agricultura e silvicultura¹. Essas vespas diminutas passam por seus estágios imaturos dentro do ovo hospedeiro, característica que apresenta desafios na condução de experimentos com RNAi ^5,18. Este estudo oferece um guia visual abrangente para a realização de experimentos ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x ES Taq MasterMix (Dye)	Cowin Biotech, China	CW0690H	To amplify the dsRNA sequences
20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6)	Sangon Biotech, China	B540627-0500	To dilute dsRNA
Agar strip	Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China	n/a	To make culture medium
Ampicillin sodium	Sangon Biotech, China	A610028	To make culture medium
Bioer Constant temperature metal bath	BIOER, China	MB-102	To synthesis dsRNA
Borosilicate glass capillary	WPI, USA	1B100-4	To pull capillary glass needle
Clean bench	Airtech, China	SW-CJ-1FD	To extract RNA
Double distilled water	Sangon Biotech, China	A500197-0500	To dilute cDNA
Environmental Testing chamber	Panasonic, Japan	MLR-352H-PC	To culture T. denrolimi
Eppendorf Centrifuge	Eppendrof, Germany	5418R	To store RNA content
Eppendorf FemtoJet 4i	Eppendrof, Germany	FemtoJet 4i	To inject T. denrolimi
Eppendorf Refrigerated Centrifuge	Eppendrof, Germany	5810R	Centrifuge
Ethanol solution (75%, RNase-free)	Aladdin, China	M052131-500ml	To extract RNA
Gel Extraction Kit	Omega, USA	D25000-02	To extract cDNA
GUM Arabic	Solarbio, China	CG5991-500g	To make egg card
Isopropyl alchohol	Aladdin, China	80109218	To extract RNA
Laser-Based Micropipette Puller	SUTTER, USA	P-2000	To pull capillary glass needle
Microloader	Eppendrof, Germany	20 µL	To load dsRNA
Multi-sample tissue grinder	LICHEN, China	LC-TG-24	To grind T. denrolimi
Needle Grinder	SUTTER, USA	BV-10-E	To grind capillary glass needle
Nuclease-Free Water	Sangon Biotech, China		To dilute RNA
OLYMPUS Microscope	OLYMPUS, Japan	XZX16	To observe T. denrolimi
PCR machine	Bio-rad, USA	S-1000	For DNA amplification
PowerPac Basic	Bio-rad, USA	PowerPacTM Basic	To detect the quality of dsRNA
Primer of dsGFP (Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA
Primer of dsGFP (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG
Primer of Ferhch for qPCR (Forward)			TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT
Primer of Ferhch for qPCR (Reverse)			CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT
Primer of Ferhch for RNAi (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC
Primer of Ferhch for RNAi(Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG
Primer of FoxO for qPCR (Forward)			CTACGCCGATCTCATAACGC
Primer of FoxO for qPCR (Reverse)			TGCTGTCGCCCTTGTCCT
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)	TaKaRa, Japan	RR047A
Quantitative Real-time PCR	Bio-rad, USA	CFX 96 Touch	To perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Tool			https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/
T7 RiBoMAX Express RNAi System	Promega, USA	P1700	To synthesis dsRNA  in vitro
TB Green Premix Ex TaqTM (Til RnaseH Plus)	TaKaRa, Japan	RR820A	To perform RT-qPCR
Trichloromethane	KESHI, China	GB/T682-2002	To extract RNA
TRIzol Reagent	Ambion, USA	15596018	To extract total RNA content from samples
Ultra-low Temperature Freezer	Thermo, USA	Forma 911