هذا البروتوكول مهم لأنه ، على حد علمنا ، أول بروتوكول يصف معدنا جديدا قائما على أجهزة الطرد المركزي لتنقية البوليسوم الحركي من العقيدات التكافلية لفول الصويا. الميزة الكبيرة لهذه التقنية هي أنه بالاشتراك مع RNA-Seq ، يسمح بدراسة العلاقة وتنظيمها في نسيج معقد مثل العقيدات التكافلية. للبدء ، وزن حوالي 0.2 جرام من العقيدات السليمة في طبق وزن ، ونقلها إلى أنبوب ملليلتر مبرد مسبقا.
ثم أضف 1.2 ملليلتر من المخزن المؤقت لاستخراج polysome ، واترك العينة تذوب لمدة دقيقتين ، وتجانس مع مطحنة الأنسجة حتى التعطيل الكامل والتجانس للعقيدات. بعد ذلك ، احتضن العينات على الجليد بإثارة لطيفة لمدة 10 دقائق أو حتى تتم معالجة جميع العينات وأجهزة الطرد المركزي بسرعة 16،000 مرة من الغرام لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية لتكسير الحطام. ثم ، قم باستعادة supernatant ، وكرر خطوة جهاز الطرد المركزي.
بعد استعادة مستخلص الخلايا المصفاة بعناية ، قم بنقل أليكوت 200 ميكرولتر إلى أنبوب طرد مركزي صغير نظيف 1.5 ملليلتر للعزل التام. ثم ، صب 4.5 ملليلتر من طبقة السكروز 33.5 ٪ في أنابيب أجهزة الطرد المركزي ، وإضافة 4.5 ملليلتر من طبقة 12 ٪ بعناية وببطء مع ماصة دقيقة P-1000. بعد ذلك ، ضع الأنابيب على الجليد حتى إضافة مستخلص الخلايا المصفح.
قم بتحميل ملليلتر واحد من مستخلص السيتوسوليك المصفى فوق وسادة السكروز عن طريق السحب بعناية على الجدار الجانبي للأنبوب. بعد ذلك ، انقل أنابيب أجهزة الطرد المركزي الفائقة إلى دلاء مبردة مسبقا ، وأجهزة طرد مركزي عند 217،874 جم لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية. بعد التخلص من المستخلص الخلوي المتبقي ووسادة السكروز ، أعد تعليق الكريات متعددة الصبغيات مع 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المبرد مسبقا لإعادة التعليق.
بعد ذلك ، احتضن لمدة 30 دقيقة على الجليد ، ثم انقل إعادة التعليق المتعدد الصبغيات إلى أنابيب مبردة مسبقا بمقدار 1.5 ملليلتر للمضي قدما في استخراج الحمض النووي الريبي. بعد تجانس العينات مع 750 ميكرولتر من كاشف عزل الحمض النووي الريبي تحضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم ، أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم البارد ، وهز الأنابيب بقوة لمدة 15 ثانية.
بعد ذلك ، احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. جهاز طرد مركزي بسرعة 12،000 مرة G لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية لفصل الطور ، ونقل 500 ميكرولتر من المرحلة المائية العليا إلى أنبوب نظيف دون إزعاج المرحلة العضوية الوردية. ثم ، أضف 375 ميكرولتر من الأيزوبروبانول البارد و 0.5 ميكرولتر من الجليكوجين الخالي من الحمض النووي الريبي.
بعد ذلك ، اخلطي جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. احتضن المزيج لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، وجهاز طرد مركزي عند 12000 مرة G لمدة 15 دقيقة. ثم ، تخلص من supernatant ، واغسل راسب الحمض النووي الريبي مع ملليلتر واحد من الإيثانول البارد ، 75٪.
مزيج عن طريق دوامة قصيرة. بعد ذلك ، جهاز طرد مركزي عند 7،500 غرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت ، وجفف حبيبات الحمض النووي الريبي في الهواء.
ثم ، قم بإذابة الكريات في 50 ميكرولتر من الماء الحر للحمض النووي الريبي ، واحتضنها عند 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. قم بتقييم تركيز الحمض النووي الريبي وسلامته باستخدام الرحلان الكهربائي الشعري عالي الحساسية ، أو الرحلان الكهربائي على هلام أغاروز خال من الحمض النووي الريبي بنسبة 2٪. بعد تقدير حجم العينة ، أضف 0.1 حجم من ثلاثة أسيتات الصوديوم المولية ، وثلاثة أحجام من الإيثانول البارد ، و 0.5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي ، الجليكوجين الحر.
ثم امزجها جيدا. تم إجراء الرحلان الكهربائي الشعري للعديد من أجزاء عينة الحمض النووي الريبي المرتبطة الكلية والمتعددة الصبغيات ، والتي أظهرت نطاقات الحمض النووي الريبوسومي الحادة ، دون أي مظهر ملطخ. ومع ذلك ، لا ينعكس هذا في قيم RIN ، لأنها تتراوح بين 5.9 و 7.5 ، والتي تتوافق مع العينات غير السليمة.
فشل المحلل الحيوي في تحديد قمم 18S و 25S كما هو موضح في الفيروجرامات الكهربائية ، سواء بالنسبة لعينات الحمض النووي الريبي المرتبطة الكلية أو المتعددة. ولم تكن هناك أي علامة مرئية على تدهور العينة. ومع ذلك ، تم تحليل عينة لتصور نتيجة عينة متدهورة بالكامل تقريبا ، للمقارنة.
الشيء الأكثر أهمية هو العمل في ظروف الحفاظ على الحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبي خلال البروتوكول بأكمله. بعد تسلسل الكسور الكلية والاسمية للحمض النووي الريبي يمكن استخدام الأنماط القياسية للتعبير الجيني الذي تم تحليله لتحديد الجينات التعبيرية التفاضلية على مستوى النسخ والترجمة.
