大豆共生结节多聚体纯化

该协议意义重大，因为据我们所知，它是第一个描述一种新的离心机金属，用于从大豆共生结核中动态多体纯化。该技术的最大优点是与RNA-Seq结合，允许研究在诸如共生结节的复杂组织中组织的关系。首先，在称量盘中称量约0.2克完整的结节，并将它们转移到预冷的两毫升管中。

然后加入1.2毫升多聚体提取缓冲液，让样品解冻两分钟，并用组织研磨机匀浆，直到结节完全破碎和均质化。接下来，将样品在冰上轻轻搅拌孵育10分钟或直到所有样品都经过处理，并在4摄氏度下以16， 000倍G离心15分钟以沉淀碎片。然后，回收上清液，并重复离心步骤。

仔细回收澄清的胞质提取物后，将200微升等分试样转移到干净的1.5毫升微量离心管中进行完全分离。然后，将4.5毫升33.5%蔗糖层倒入离心管中，并用P-1000微量移液器小心缓慢地加入4.5毫升12%层。接下来，将试管放在冰上，直到加入澄清的胞质提取物。

小心地移液到管的侧壁上，将一毫升澄清的胞质提取物装载到蔗糖垫的顶部。然后，将超离心管转移到预冷的桶中，并在 217， 874 G 的温度下在 4 摄氏度下离心两个小时。丢弃剩余的胞质提取物和蔗糖垫后，用200微升预冷的重悬缓冲液重新悬浮多体沉淀。

接下来，在冰上孵育30分钟，然后将多体重悬转移到1.5毫升预冷管中进行RNA提取。用750微升RNA分离试剂匀浆样品后，在室温下孵育5分钟。然后，加入200微升冷氯仿，用力摇动试管15秒。

接下来，在室温下孵育 10 分钟。在4摄氏度下以12，000倍G离心15分钟进行相分离，并将500微升上层水相转移到干净的管中，而不会干扰粉红色有机相。然后，加入375微升冷异丙醇和0.5微升RNA游离糖原。

之后，通过上下移液彻底混合。将混合物在 4 摄氏度下孵育 10 分钟，并以 12， 000 倍 G 离心 15 分钟。然后，弃去上清液，并用一毫升冷的75%乙醇洗涤RNA沉淀。

通过短暂的涡旋混合。接下来，在 7， 500 G 下在 4 摄氏度下离心五分钟。弃去上清液，风干RNA沉淀。

然后，将沉淀溶解在50微升RNA游离水中，并在65摄氏度下孵育五分钟。使用高灵敏度毛细管电泳和/或在 2%RNA 游离琼脂糖凝胶上进行电泳评估 RNA 浓度和完整性。估计样品体积后，加入0.1体积的三摩尔乙酸钠，三体积的冷乙醇和0.5微升RNA，游离糖原。

然后，将它们彻底混合。对几种总和多体相关RNA样品级分进行了毛细管电泳，显示出清晰的核糖体RNA条带，没有任何拖尾的外观。但是，这并未反映在RIN值中，因为它们的范围在5.9和7.5之间，对应于非完整样品。

生物分析仪未能识别电泳图中显示的18S和25S峰，包括总和多体相关RNA样品。没有样品降解的视觉迹象。但是，对样品进行了分析，以可视化几乎完全降解的样品的结果，以便进行比较。

最重要的是在整个协议期间在多聚体和RNA保存条件下工作。测序后，所分析基因表达的总和帕尔RNA级分标准模式可用于鉴定转录和翻译水平的差异表达基因。