Этот протокол важен, потому что, насколько нам известно, он является первым, который описывает новый металл на основе центрифуги для очистки кинетических полисом от симбиотических конкреций сои. Большим преимуществом данной методики является то, что в сочетании с РНК-Seq, позволяет изучать отношения и организуется в сложную ткань, такую как симбиотический узелок. Для начала взвесьте примерно 0,2 грамма неповрежденных конкреций в весовой посуде и переложите их в предварительно охлажденную двухмиллилитровую трубку.
Затем добавляют 1,2 миллилитра буфера экстракции полисом, дают образцу оттаивать в течение двух минут и гомогенизируют тканевой шлифовальной машиной до полного разрушения и гомогенизации конкреций. Затем инкубируйте образцы на льду с мягким перемешиванием в течение 10 минут или до тех пор, пока все образцы не будут обработаны, и центрифугируйте в 16 000 раз G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы гранулировать мусор. Затем извлеките супернатант и повторите шаг центрифуги.
После тщательного извлечения осветленного цитозольного экстракта перенесите 200-микролитровую аликвоту в чистую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку для полной изоляции. Затем налейте 4,5 миллилитра слоя сахарозы 33,5% в трубки центрифуги и аккуратно и медленно добавьте 4,5 миллилитра 12%-го слоя микропипеткой P-1000. Далее кладут трубки на лед до добавления осветленного цитозольного экстракта.
Загрузите один миллилитр осветленного цитозольного экстракта поверх подушки сахарозы, тщательно пипетировав на боковую стенку трубки. Затем перенесите ультрацентрифужные трубки в предварительно охлажденные ведра и центрифугу при 217, 874 G в течение двух часов при четырех градусах Цельсия. После выброса оставшегося цитозольного экстракта и сахарозной подушки повторно суспендируйте полисомальную гранулу с 200 микролитрами предварительно охлажденного буфера повторной суспензии.
Далее инкубируют в течение 30 минут на льду, а затем переносят полисомальную повторную суспензию в 1,5 миллилитра предварительно охлажденных пробирок, чтобы приступить к экстракции РНК. После гомогенизации образцов 750 микролитрами выделения РНК реагент инкубируют в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем добавьте 200 микролитров холодного хлороформа и энергично встряхните трубки в течение 15 секунд.
Далее инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут. Центрифуга в 12 000 раз G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия для разделения фаз и перенос 500 микролитров верхней водной фазы в чистую трубку, не нарушая розовую органическую фазу. Затем добавляют 375 микролитров холодного изопропанола и 0,5 микролитра РНК свободного гликогена.
После этого тщательно перемешайте, пипеткой вверх и вниз. Инкубируйте смесь в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и центрифугируйте в 12 000 раз g в течение 15 минут. Затем выбросьте супернатант и промыте осадок РНК одним миллилитром холодного, 75% этанола.
Перемешать коротким вихрем. Далее центрифугируют при 7 500 Г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Выбросьте надосадочный материал и высушите гранулу РНК на воздухе.
Затем растворите гранулу в 50 микролитрах свободной воды РНК и инкубируйте при 65 градусах Цельсия в течение пяти минут. Оцените концентрацию и целостность РНК с помощью высокочувствительного капиллярного электрофореза и, или электрофореза, на 2%-ном геле агарозы, свободном от РНК. После оценки объема образца добавляют 0,1 объема трех молярных ацетата натрия, три объема холодного этанола и 0,5 микролитра РНК, свободный гликоген.
Затем тщательно перемешайте их. Капиллярный электрофорез проводили для нескольких общих и полисомальных ассоциированных фракций образцов РНК, которые демонстрировали острые рибосомные полосы РНК, без какого-либо смазанного вида. Однако это не отражено в значениях RIN, поскольку они находятся в диапазоне от 5,9 до 7,5, что соответствует неповрежденным образцам.
Биоанализатор не смог идентифицировать пики 18S и 25S, как видно на электроферограммах, как для общих, так и для полисомных ассоциированных образцов РНК. Визуальных признаков деградации образца не было. Тем не менее, образец был проанализирован для визуализации результата почти полностью деградированного образца для сравнения.
Самое главное – работать в полисомных и РНК-сохраняющих условиях в течение всего протокола. После секвенирования общей и парной фракций РНК стандартные паттерны для анализируемой экспрессии генов могут быть использованы для идентификации дифференциальных экспресс-генов на уровне транскрипции и трансляции.
