Bu protokol önemlidir, çünkü bildiğimiz kadarıyla, soya fasulyesi simbiyotik nodüllerinden kinetik polizom saflaştırması için yeni bir santrifüj bazlı metali tanımlayan ilk protokoldür. Bu tekniğin en büyük avantajı, RNA-Seq ile kombinasyon halinde, ilişkinin incelenmesine izin vermesi ve simbiyotik nodül gibi karmaşık bir dokuda organize olmasıdır. Başlamak için, bir tartım kabında yaklaşık 0,2 gram bozulmamış nodül tartın ve bunları önceden soğutulmuş iki mililitrelik bir tüpe aktarın.
Daha sonra 1.2 mililitre polizom ekstraksiyon tamponu ekleyin, numunenin iki dakika boyunca çözülmesine izin verin ve nodüllerin tamamen bozulmasına ve homojenizasyonuna kadar bir doku öğütücü ile homojenize edin. Daha sonra, numuneleri 10 dakika boyunca veya tüm numuneler işlenene kadar yumuşak ajitasyonla buz üzerinde inkübe edin ve enkazı peletlemek için dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 16.000 kez G'de santrifüj yapın. Ardından, süpernatanı kurtarın ve santrifüj adımını tekrarlayın.
Arıtılmış sitozolik ekstraktı dikkatlice geri kazandıktan sonra, 200 mikrolitrelik bir alikotu toplam izolasyon için temiz bir 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra,% 33.5 sakkaroz tabakasının 4.5 mililitresini santrifüj tüplerine dökün ve% 12'lik tabakanın 4.5 mililitresini bir P-1000 mikropipet ile dikkatlice ve yavaşça ekleyin. Daha sonra, berraklaştırılmış sitozolik ekstraktın eklenmesine kadar tüpleri buz üzerine koyun.
Arıtılmış sitozolik ekstraktın bir mililitresini, tüpün yan duvarına dikkatlice pipetleyerek sakkaroz yastığının üzerine yükleyin. Ardından, ultra santrifüj tüplerini önceden soğutulmuş kovalara aktarın ve dört santigrat derecede iki saat boyunca 217.874 G'de santrifüj yapın. Kalan sitozolik ekstraktı ve sakkaroz yastığını attıktan sonra, polisomal peleti 200 mikrolitre önceden soğutulmuş yeniden süspansiyon tamponu ile yeniden askıya alın.
Daha sonra, buz üzerinde 30 dakika inkübe edin ve ardından RNA ekstraksiyonuna devam etmek için polisomal yeniden süspansiyonu 1.5 mililitre önceden soğutulmuş tüplere aktarın. Numuneler 750 mikrolitre RNA izolasyon reaktifi ile homojenize edildikten sonra oda sıcaklığında beş dakika inkübe edilir. Ardından, 200 mikrolitre soğuk kloroform ekleyin ve tüpleri 15 saniye boyunca kuvvetlice sallayın.
Daha sonra, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Faz ayrımı için dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 12.000 kez G'de santrifüj yapın ve pembe organik fazı bozmadan üst sulu fazın 500 mikrolitresini temiz bir tüpe aktarın. Daha sonra, 375 mikrolitre soğuk izopropanol ve 0.5 mikrolitre RNA serbest glikojeni ekleyin.
Daha sonra, yukarı ve aşağı pipetleyerek, iyice karıştırın. Karışımı dört santigrat derecede 10 dakika boyunca inkübe edin ve 15 dakika boyunca 12.000 kez G'de santrifüj yapın. Daha sonra, süpernatanı atın ve RNA çökeltiyi bir mililitre soğuk,% 75 etanol ile yıkayın.
Kısa girdapla karıştırın. Daha sonra, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 7.500 G'de santrifüj yapın. Süpernatanı atın ve RNA peletini hava ile kurutun.
Daha sonra, peleti 50 mikrolitre RNA serbest suda çözün ve beş dakika boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. RNA konsantrasyonunu ve bütünlüğünü, son derece hassas kılcal elektroforez veya% 2'lik bir RNA serbest agaroz jeli üzerindeki elektroforez ile değerlendirin. Numune hacmini tahmin ettikten sonra, 0.1 hacim üç molar sodyum asetat, üç hacim soğuk etanol ve 0.5 mikrolitre RNA, serbest glikojen ekleyin.
Ardından, onları iyice karıştırın. Kılcal elektroforez, herhangi bir bulaşma görünümü olmadan, keskin ribozomal RNA bantları gösteren birkaç total ve polisomal ilişkili RNA numune fraksiyonu için gerçekleştirildi. Ancak bu, bozulmamış örneklere karşılık gelen 5,9 ile 7,5 arasında değiştiğinden RIN değerlerine yansıtılmaz.
Biyoanalizör, hem toplam hem de polizomla ilişkili RNA örnekleri için elektroferogramlarda görüldüğü gibi 18S ve 25S zirvelerini tanımlayamadı. Numune yıkımının görsel bir belirtisi yoktu. Bununla birlikte, karşılaştırma için neredeyse tamamen bozulmuş numunenin sonucunu görselleştirmek için bir numune analiz edildi.
En önemli şey, tüm protokol boyunca polizom ve RNA koruma koşullarında çalışmaktır. Toplam ve par RNA fraksiyonlarını sıraladıktan sonra, analiz edilen gen ekspresyonu için standart kalıplar, transkripsiyon ve translasyon seviyesindeki diferansiyel ekspres genleri tanımlamak için kullanılabilir.
