이 프로토콜은 우리가 아는 한 대두 공생 결절에서 키네틱 폴리솜 정제를 위한 새로운 원심분리기 기반 금속을 설명하는 최초의 프로토콜이기 때문에 중요합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 RNA-Seq와 결합하여 공생 결절과 같은 복잡한 조직으로 조직화되고 관계를 연구 할 수 있다는 것입니다. 시작하려면 칭량 접시에서 손상되지 않은 결절 약 0.2g의 무게를 측정하고 사전 냉각된 2밀리리터 튜브로 옮깁니다.
그런 다음 1.2ml의 폴리솜 추출 버퍼를 추가하고 샘플을 2분 동안 해동한 다음 결절이 완전히 파괴되고 균질화될 때까지 조직 분쇄기로 균질화합니다. 다음으로, 10 분 동안 또는 모든 샘플이 처리 될 때까지 부드러운 교반으로 얼음 위에서 샘플을 배양하고 섭씨 4도에서 15 분 동안 16, 000 배 G에서 원심 분리하여 파편을 펠릿화합니다. 이어서, 상청액을 회수하고, 원심분리 단계를 반복한다.
정화된 세포질 추출물을 조심스럽게 회수한 후, 200 마이크로리터 분취량을 깨끗한 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 완전히 분리합니다. 그런 다음 4.5 밀리리터의 33.5 % 자당 층을 원심 분리기 튜브에 붓고 P-1000 마이크로 피펫으로 12 % 층의 4.5 밀리리터를 조심스럽게 천천히 첨가합니다. 다음으로, 정화 된 세포질 추출물이 첨가 될 때까지 튜브를 얼음 위에 올려 놓으십시오.
정화된 세포질 추출물 1밀리리터를 튜브의 측벽에 조심스럽게 피펫팅하여 자당 쿠션 위에 놓습니다. 그런 다음 초 원심 분리 튜브를 사전 냉각 된 버킷으로 옮기고 섭씨 4도에서 2 시간 동안 217, 874G에서 원심 분리합니다. 남아 있는 시토졸 추출물 및 슈크로스 쿠션을 버린 후, 200 마이크로리터의 미리 냉각된 재현탁 완충액으로 폴리좀 펠릿을 재현탁시킨다.
다음으로, 얼음 위에서 30분 동안 배양한 다음, 폴리솜 재현탁액을 1.5밀리리터 예냉관으로 옮겨 RNA 추출을 진행한다. 샘플을 750 마이크로리터의 RNA 분리 시약으로 균질화한 후 실온에서 5분 동안 배양한다. 그런 다음 200 마이크로 리터의 차가운 클로로포름을 넣고 튜브를 15 초 동안 세게 흔 듭니다.
다음으로, 실온에서 10 분 동안 배양한다. 상 분리를 위해 섭씨 4도에서 15 분 동안 12, 000 회 G에서 원심 분리하고, 분홍색 유기 상을 방해하지 않고 상부 수성 상 500 마이크로 리터를 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 375 마이크로 리터의 차가운 이소프로판올과 0.5 마이크로 리터의 RNA가없는 글리코겐을 첨가하십시오.
그런 다음 위아래로 피펫팅하여 완전히 혼합합니다. 혼합물을 섭씨 4도에서 10 분 동안 배양하고 15 분 동안 12, 000 회 G에서 원심 분리합니다. 이어서, 상청액을 버리고, RNA 침전물을 1 밀리리터의 차가운 75% 에탄올로 세척한다.
간단한 소용돌이로 혼합하십시오. 다음으로, 섭씨 4도에서 5 분 동안 7, 500G에서 원심 분리하십시오. 상청액을 버리고 RNA 펠릿을 자연 건조시킵니다.
이어서, 펠릿을 50 마이크로리터의 RNA 자유수에 녹이고, 섭씨 65도에서 5분 동안 배양한다. 고감도 모세관 전기영동 및, 또는 2%RNAs 유리 아가로스 겔에 대한 전기영동으로 RNA 농도와 무결성을 평가합니다. 샘플 부피를 추정 한 후 0.1 부피의 3 몰 아세트산 나트륨, 3 부피의 차가운 에탄올 및 0.5 마이크로 리터의 RNA (유리 글리코겐)를 첨가하십시오.
그런 다음 철저히 섞으십시오. 모세관 전기 영동은 여러 개의 전체 및 다염색체 관련 RNA 샘플 분획에 대해 수행되었으며, 이는 번진 모양없이 날카로운 리보솜 RNA 밴드를 보여주었습니다. 그러나 RIN 값은 손상되지 않은 샘플에 해당하는 5.9에서 7.5 사이이므로 RIN 값에 반영되지 않습니다.
바이오 분석기는 전체 및 폴리 솜 관련 RNA 샘플 모두에 대해 전기 페로 그램에서 볼 수있는 18S 및 25S 피크를 식별하지 못했습니다. 샘플 분해의 시각적 징후는 없었습니다. 그러나 비교를 위해 거의 완전히 분해 된 샘플의 결과를 시각화하기 위해 샘플을 분석했습니다.
가장 중요한 것은 전체 프로토콜 동안 폴리솜 및 RNA 보존 조건에서 작업하는 것입니다. 전체 및 par RNA 분획을 시퀀싱한 후 유전자 발현 분석을 위한 표준 패턴은 전사 및 번역 수준에서 차등 발현 유전자를 확인하는데 사용될 수 있다.
