يوضح هذا البروتوكول طبقا لثقافة الخلايا المجهرية مصمم لنمو مئات الكائنات العضوية مع معرفة المواد ومتوافق تماما مع الفحص المجهري. تسمح تقنيتنا بكفاءة بتوليد الآلاف من الكائنات العضوية ، متوافقة تماما مع التصوير طويل المدى وزراعة الخلايا على المدى الطويل. هذا البروتوكول ذو أهمية كبيرة للتطبيقات الطبية الحيوية مثل خط أنابيب فحص الأدوية ومجالات أبحاث السرطان.
من السهل إتقان التقنية المقدمة في هذا البروتوكول بعد بضع محاولات من قبل أي شخص لديه خبرة في الإجراءات المختبرية والفحص المجهري الضوئي. للبدء ، قم بقص أجزاء صغيرة من قالب PDMS إلى البعد المطلوب للجهاز النهائي. قصها بالتوازي مع اتجاهات XY للمصفوفة.
ضع أحد نرد قالب PDMS المحضر ووجهه لأسفل على قسم PDMS المسطح. ثم باستخدام ماصة ، أضف ما يقرب من 0.1 إلى 0.2 ملليلتر من المادة اللاصقة القابلة للشفاء بالأشعة فوق البنفسجية إلى جانب واحد من القالب. اتبع تقدم السائل داخل التجويف باستخدام مجهر بصري مقلوب عند تكبير 10X.
تعريض المادة اللاصقة لضوء الأشعة فوق البنفسجية لعلاجها. اضبط وقت التعرض اعتمادا على كثافة طاقة مصدر الأشعة فوق البنفسجية كما هو موضح في مخطوطة النص. باستخدام الكمية الزائدة من المادة اللاصقة على حافة واحدة ، أمسك المادة اللاصقة المعالجة على ركيزة PDMS المسطحة عن طريق الضغط عليها برفق بإصبعك.
في هذه الأثناء ، باستخدام الملقط ، اضغط على زاوية واحدة من القالب بجوار نفس الحافة التي يتم الضغط عليها لأسفل وقشر القالب ببطء ، مع التأكد من عدم رفع الفيلم المحكم. قم بقص المادة اللاصقة الزائدة وركيزة PDMS باستخدام شفرة حلاقة لترك الطبقة المعالجة والمزخرفة واللاصقة مسطحة على PDMS مع وجود الركيزة الزائدة على حافة واحدة فقط. عالج غطاء نظيف بعملية بلازما أكسجين قصيرة لتحسين حبه للماء.
بعد تنشيط البلازما ، قم بلف الطبقة الرقيقة من المادة اللاصقة القابلة للشفاء بالأشعة فوق البنفسجية عن طريق وضع الغطاء على ظرف الفراغ لطبقة الدوران القياسية وسكب قطرة صغيرة من المادة اللاصقة في وسط غطاء الغطاء. قم بتشغيل عملية طلاء الدوران كما هو موضح في مخطوطة النص. في حالة عدم توفر طلاء الدوران ، قم بإسقاط ما يقرب من 0.1 ملليلتر من المادة اللاصقة القابلة للشفاء بالأشعة فوق البنفسجية على غطاء نظيف باستخدام ماصة.
خذ غطاء ثان وضعه فوق الأول لجعل المادة اللاصقة السائلة تنتشر بالتساوي بين الغطاءين. بمجرد وصول المادة اللاصقة إلى حافة أغطية الغطاء ، افصلها برفق عن طريق تحريك واحدة فوق الأخرى. بمجرد فصلهما ، سيتم طلاء كلا الغطاءين بالكامل بطبقة رقيقة من المادة اللاصقة السائلة.
بعد طلاء الدوران ، قم بمعالجة المادة اللاصقة مسبقا عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية. اضبط وقت التعرض اعتمادا على كثافة الطاقة لمصدر الأشعة فوق البنفسجية المستخدم. خذ أحد الأفلام المزخرفة وضعها على اتصال مع الغطاء المطلي اللاصق. تأكد من أن التلامس بين المادة اللاصقة المعالجة جزئيا والفيلم المحكم موحد قدر الإمكان.
في هذه المرحلة ، يجب أن تكون المادة اللاصقة الموجودة على غطاء الغطاء صلبة بدرجة كافية لتجنب إعادة التدفق ويمكن تحسين التلامس عن طريق الضغط برفق على غطاء الغطاء. قم بتعريض الأغطية لضوء الأشعة فوق البنفسجية حتى يتم علاج الطبقة اللاصقة المطلية بالكامل. سيؤدي ذلك إلى إغلاق الفيلم المحكم على غطاء الغطاء وتوفير عزل مانع للتسرب بين تجاويف المحيط.
ثم باستخدام الملقط ، اضغط على PDMS على الحافة حيث تركت المواد الزائدة بعد التشذيب وتقشير الركيزة المسطحة PDMS. تمكن هذه الخطوة طبقة الفيلم المحكم من الالتصاق بغطاء الغطاء مع وصول مفتوح في الأعلى لبذر الخلية. قبل بذر الخلية ، على جهاز تم تخميله باستخدام البوليمر المشترك البيومتري كما هو موضح في المخطوطة ، قم بتوزيع ملليلتر واحد من PBS المعقم في أطباق بتري لزراعة الخلايا 35 ملم.
قم بإزالة الطبق باستخدام PBS المعقم باستخدام غرفة التفريغ لمدة 10 دقائق ، تليها عدة جولات من السحب لإزالة جميع الفقاعات. استبدل PBS بوسط ثقافة معقم وقم بتعقيم اللوحة بضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة تحت غطاء زراعة الخلية. قم بإعداد معلق خلوي باتباع توصيات إعداد التربسين أو تعليق الخلية للخلايا ذات الأهمية كما هو موضح في مخطوطة النص.
عد واضبط تركيز الخلية إلى 500،000 خلية لكل ملليلتر في وسط زراعة الخلايا الموصى به. قم بإزالة المخزن المؤقت PBS من طبق زراعة الخلايا 35 ملم ثم قم بتوزيع ملليلتر واحد من تعليق الخلية المعدل. ضع طبق زراعة الخلايا مرة أخرى في حاضنة الخلية لمدة 10 دقائق.
ستدخل ما يقرب من 80 إلى 100 خلية إلى كل تجويف محيط. بعد حوالي 10 دقائق من الحضانة ، استرجع طبق زراعة الخلايا من الحاضنة واستنشق المعلق الخلوي برفق لإزالة الخلايا غير المحاصرة. أضف ملليلترا واحدا من وسط الاستزراع إلى طبق الاستزراع وضعه مرة أخرى في حاضنة الخلية.
اختياريا ، لاسترداد المواد العضوية بعد نموها في الآبار ، اضغط على الطبقة اللاصقة المحكم على الحافة المقطوعة باستخدام ملاقط وقشرها برفق من الغطاء الزجاجي ، ولكن احتفظ بها مغمورة في الوسط. زيادة تركيز البوليمر المشترك البيومتري زاد من سمك الطلاء. كان التفريغ الكامل لأطباق زراعة الخلايا ضروريا لإزالة فقاعات الهواء المحاصرة في التجاويف المحيطة.
تشكلت المواد العضوية بعد اليومين الثاني و 15 من الزراعة. أظهر المجهر البؤري للقرص الدوار صورا تمثيلية للعضويات وإعادة بناء 3D. عند تحضير طبق الاستزراع ، من المهم الانتباه إلى تجميع القالب أو كومة الركيزة وضمان الاتصال الجيد بين الفيلم المحكم وغطاء الغطاء.
وقد اجتذب الاحتواء الذي توفره تجاويفنا الدقيقة وغياب الخسارة المادية انتباه الباحثين في مجال بيولوجيا الفضاء المهتمين بدراسة تأثير الجاذبية الصغرى على التوازن العضوي.
