Als wichtiges Mineralelement spielt Kalzium eine Schlüsselrolle beim Wachstum und der Qualitätskontrolle von Baumfrüchten wie Apfel, es kann die Härte, den Zuckergehalt, die Lagerdauer und die physiologische Störung während der Lagerung regulieren. Die Calcium-Bildgebung ist die westlichste Methode, um dynamische Veränderungen der Kalziumionen im Zytoplasma nachzuweisen. Niedermolekulare Fluoreszenzindikatoren wie Fluo-4 / AM haben eine Kalziumionen-spezifische Selektivität und können durch Veresterungsinkubation, die flexibel, schnell und nicht zytotoxisch ist, nichtinvasiv belastet werden.
Dieses Protokoll wird eine Methode zum Laden von niedermolekularem chemischem fluoreszierendem Reagenz Fluo-4 / AM in pflanzliche Protoplasten einführen. Protoplastenextraktion 0,5 Milliliter Enzymlösung in ein 1,5 Milliliter Zentrifugenröhrchen geben. Wählen Sie einen gesunden und reifen Apfel und schneiden Sie das Fruchtfleisch in 10 mal 5 mal 1 Kubikliter Größe.
Legen Sie die Zellstoffstücke in enzymatische Lösung und schließen Sie dann das Röhrchen. Inkubieren Sie die Tube bei 28 Grad für eine Stunde. Bei 70 U/min im Dunkeln gehackt.
Danach waschen Sie die Zellstoffstücke, saugen die gesamte enzymatische Lösung an und fügen dann 0,5 Milliliter Grundlösung hinzu. Zentrifuge mit einer Geschwindigkeit von 300 g für 2 Minuten. Protoplasten Suspension kann durch Absaugen der Bodenlösung erhalten werden.
Niedermolekulare chemische Fluoreszenzreagenzfärbung. Bereiten Sie die Fluo-4/AM-Ladelösung mit einem 2 Millimolar-Fluo-4/AM, 20% Ethyl127 und der 10-fach phosphatgepufferten Kochsalzlösung in einem Verhältnis von eins zu eins zu zwei vor. Fügen Sie 1 Mikroliter Ladelösung von Fluo-4 / AM zu 99 Mikroliter Protoplast suspension hinzu.
Die Endkonzentration der fluoreszierenden Farbstoffe beträgt 5 Mikromolaren. Mischen Sie die Lösung und schließen Sie dann die Tube. Gleichzeitig ist Lanthan das Kalzium oder die Einzigartigkeit des kleinmolekularen chemischen Fluoreszenzmittels.
Fügen Sie einen Mikroliter oder 10 Mikroliter mehr Lanthaneisen und dann eine Mikroliter-Ladelösung von Fluo-4 / AM zu 98 Mikroliter Protoplasten Suspension hinzu. Die Endkonzentration von Lanthaneisen beträgt 100 Mikromolare. Mischen Sie die Lösung und schließen Sie dann die Tube.
Bei 37 Grad 30 Minuten im Dunkeln inkubieren. Danach zentrifugieren Sie mit einer Geschwindigkeit von 300 G für zwei Minuten. Auf 17 Mikroliter Lösung absaugen und eine 17 Mikroliter Basislösung hinzufügen.
Inkubieren Sie die Protoplastensuspension bei 37 Grad für 30 Minuten, um sie vollständig danach abzusaugen, 50 Mikroliter Protoplasten Suspension abzusaugen und auf einen Objektträger zu tropfen. Unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachten. Wählen Sie das 20-fache der Vergrößerung und den GFP-Kanal aus, der beobachtet werden soll.
Stellen Sie die Helligkeit gleichmäßig auf 0,5 ein. Ein kritischer Schritt bei dieser vorgeschlagenen Methode besteht darin, den Fleck in den Protoplasten zu waschen und sie 30 Minuten lang zu inkubieren. Unzureichendes Waschen verursacht übermäßigen Backer auf der Fluoreszenz während der Beobachtung und Inkubation ermöglicht eine bessere Belastung oder die Sonde in das Zytoplasma.
Protoplasten Viability Assay Nehmen Sie 99 Mikroliter Protoplasten Suspension nach inkubation bei 37 Grad für 30 Minuten. Fügen Sie 1 ml an der FD-Lösung zur Protoplastensuspension hinzu. Mischen Sie die Lösung, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren und dann das Rohr schließen.
Bleiben Sie bei Raumtemperatur für fünf Minuten im Dunkeln. Bereiten Sie die Objektträger vor und beobachten Sie sie auf dem Fluoreszenzmikroskop mit GFP-Kanal. Wir präsentieren Ihnen die Ergebnisse im Folgenden in Abbildung eins.
Wir verwenden die enzymatische Methode, um Protoplasten aus der Pulpa zu erhalten. Einige Protoplasten hatten eine Vakuole, andere nicht. Die Protoplasten wurden fünf Minuten lang mit FD gefärbt und zeigen die Blütenbildung im Zytoplasma, was darauf hindeutet, dass hohe Temperaturen von 37 Grad die Lebensfähigkeit oder Protoplasten nicht beeinträchtigen Abbildung zwei.
Die Protoplasten zeigten keine Fluoreszenz in einem der Kalziumeisen-Fluoreszenzindikatoren oder es ist nicht in sie geladen. Als in Fluo-4/AM in den Protoplasten geladen wurde, wurde der Zytoplast, aber keine Vakuole fluoreszierend. Lanthan-Eisen, die effektiv Kalziumkanäle blockieren, sind die Zellmembran, wurden der Protoplast Fluo-4 / AM-Belastung hinzugefügt.
Bei der Endkonzentration von 100 mikromolaren Lanthaneisen reduzieren sie die Calciumfluoreszenzintensität signifikant. Diese Ergebnisse zeigten weiter, dass Fluo-4 / AM effektiv in den Kalziumeisen im Zytoplasten verbleibt und dynamische Veränderungen des Kalziumeisengehalts zeigt. Abbildung drei Die Fluo-4/AM-Ergebnisse wurden mit IMH-zugelassener plus 6.0-Software Fluo-4/AM-Färbung unter Zugabe von Lanthaneisen analysiert, die den Floreszenzwert von zytoplasmatischen Calciumeisen signifikant reduzierte.
In diesem Video wurden alle Protoplasten durch enzymatische Hydrolyse erhalten. Wir haben die fluoreszierenden Sonden erfolgreich bei 37 Grad in einen Protoplasten geladen. Darüber hinaus hatte die Methode keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit von Protoplasten.
Zusammenfassend lässt sich die hier beschriebene Methode in sachrend detailliert beschreiben. Die dynamischen Veränderungen der zytoplasmatischen Calciumionen in Apfelpulpazellen liefern dadurch 10 gleiche Unterstützungen für den weiteren Zweck von Calcium-bezogenen Studien.
