Ziel unserer Forschung ist es, eine neuartige in vitro Methode zur schnellen und sensitiven Bewertung der Toxizität und Ökotoxizität von Schadstoffen zu entwickeln, die auf der Bewertung der Hämozytenmotilität von Mytilus galloprovincialis als Modellorganismus basiert. Wirkungsbasierte Methoden, wie z.B. in vitro und in vivo Bioassays, stellen innovative Werkzeuge dar, um die Auswirkungen chemischer Umweltschadstoffe auf lebende Organismen nachzuweisen. Diese Methoden können als Werkzeuge für das Umweltbiomonitoring und die Risikobewertung dienen.
Diese Forschung schließt eine signifikante Lücke in der Toxikologie, indem sie sich auf die Verwendung der Hämozytenmotilität als neuen Endpunkt zur Bewertung der Wirkung von Schadstoffen auf Muscheln konzentriert. Obwohl die Motilität der Hämozyten für die Immunantwort entscheidend ist, ist ihre Empfindlichkeit gegenüber Schadstoffbelastung bei Muscheln zu wenig untersucht. Unsere Erkenntnisse bringen die Forschung in der Toxikologie und Ökotoxikologie in mehrfacher Hinsicht voran.
Indem wir einen neuen Endpunkt für das Toxizitätsscreening anbieten, die ethische Forschung durch die Minimierung von Wirbeltiertests unterstützen und die Anwendbarkeit in der Ökotoxikologie vorantreiben. Dieser Ansatz kann eine breite Anwendung im Umwelt-Biomonitoring haben und könnte für andere Immunzellen in der Ökotoxikologie adaptiert werden. Füllen Sie zunächst eine Spritze mit 0,5 Millilitern physiologischer Standardkochsalzlösung vor, die auf 15 Grad Celsius temperiert ist.
Positionieren Sie das akklimatisierte adulte Muschelexemplar für die Hämolymphensammlung. Hebeln Sie mit einem Skalpell die Klappen entlang der Bauchfläche leicht und vorsichtig auseinander. Halten Sie das Skalpell in Position oder verwenden Sie eine Pipettenspitze, um den Raum offen zu halten.
Führen Sie dann die Nadel einer Injektionsspritze in den Raum zwischen den Ventilen ein. Entnehmen Sie vorsichtig 0,5 Milliliter Hämolymphe aus dem hinteren Adduktorenmuskel mit der Fertigspritze. Entfernen Sie nun die Nadel von der Spritze und geben Sie den Inhalt der Spritze in ein Mikroröhrchen.
Die Proben von drei bis vier Muscheln werden in einem Röhrchen bei einer Temperatur von 15 Grad Celsius zusammengefasst. Nachdem Sie die Lebensfähigkeit der Hämozyten beurteilt haben, geben Sie zur Kultivierung 50 Mikroliter verdünnte Hämolymphe in die Vertiefungen einer 96-Well-Mikroplatte aus Polystyrol mit flachem Boden und TC und decken Sie die Platte mit ihrem Deckel ab. Lassen Sie die Hämozyten 30 Minuten lang bei 15 Grad Celsius am Boden der Vertiefungen haften, um eine Monoschicht zu bilden.
Saugen Sie dann mit einer Mikropipette vorsichtig überschüssige Hämolymphe aus den Vertiefungen ab. Um Kurzzeit-Assays innerhalb von ein bis vier Stunden durchzuführen, fügen Sie sofort 100 Mikroliter der in physiologischer Kochsalzlösung gelösten Substanz von Interesse hinzu. Bei längerer Exposition von 24 bis 48 Stunden sind die kultivierten adhärenten Zellen mit der im supplementierten Kulturmedium bei 15 Grad Celsius gelösten Prüfsubstanz zu inkubieren.
Zu Beginn erhalten Sie die kultivierten Hämozyten, die mit der interessierenden Substanz behandelt wurden. Um die Hämozyten besser sichtbar zu machen, entfernen Sie das Inkubationsmedium aus jeder Vertiefung und färben Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern neutraler roter Vitalfarbstoff-Färbelösung, bevor Sie sie mit dem Zeitraffermikroskop mikroskopieren. Inkubieren Sie die Zellen bei 15 Grad Celsius in einer Klimakammer für 15 Minuten.
Nach der Inkubation waschen Sie den überschüssigen Farbstoff aus und fügen Sie 100 Mikroliter der interessierenden Substanz hinzu, die in physiologischer Standardkochsalzlösung gelöst ist. Setzen Sie die Multi-Well-Platte mit den behandelten Zellen in einen Multi-Mode-Reader ein. Führen Sie Echtzeit-Bildgebung auf der Platte durch Zeitraffermikroskopie unter 20-facher Vergrößerung und Hellfeldvisualisierung durch.
Für die Zellverfolgung und die Berechnung velozimetrischer Parameter erhalten Sie die einzelnen Frames mit der Gen5-Software und speichern Sie die Bilder in einem Ordner ohne Leerzeichen im Namen. Navigieren Sie in ImageJ zu Datei, gefolgt von Importieren und Bildsequenz. Führen Sie die Zellverfolgung für einzelne Zellen mit dem manuellen Tracking-Plugin durch.
Importieren Sie Datensätze aus dem manuellen Tracking-Plugin ImageJ in die Chemotaxis and Migration Tool-Software. Wählen Sie die gewünschte Anzahl von Slices für das Tracking aus. Kalibrieren Sie die Software mit den Einstellungen für die X/Y-Pixelgröße und das Zeitintervall.
Nachdem Sie die Parameter eingestellt haben, klicken Sie auf Einstellungen übernehmen. Plotten Sie Trajektorien und exportieren Sie sie als Bild. Klicken Sie auf die Schaltfläche Messwerte, um die Ergebnisse anzuzeigen und die Daten zu speichern.
Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Statistik und speichern Sie die Geschwindigkeits- und Direktheitsdaten für die Spurserie. Die berechneten velozimetrischen Parameter der Kontrollzellen sind mit denen der Hämozyten zu vergleichen, die der Prüfsubstanz in unterschiedlichen Konzentrationen ausgesetzt waren. Die Hämozytenmotilität wurde mittels Zeitraffer-Bildgebung beurteilt, die einzelne Zellbewegungen über 10 Minuten zeigte, mit konsistenter Verfolgung der nummerierten Zellen über drei Zeitpunkte von null, fünf und 10 Minuten.
Es wurden zwei Morphotypen von Hämozyten beobachtet, sich ausbreitende Zellen und kleinere runde sternförmige Zellen. Beide Typen zeigten kontinuierliche Formveränderungen aufgrund der Aktivität von Lamellipodien und Pseudopodien. Geschwindigkeits- und Direktheitsdiagramme zeigten, dass sich die ausgebreiteten Zellen unter basalen physiologischen Bedingungen im Vergleich zu kleineren Zellen schneller bewegten.
Die Paracetamol-Exposition reduzierte die Motilität der sich ausbreitenden Zellen nach 24 Stunden signifikant, während kleine Zellen keine solche Verringerung zeigten. Die Direktheit kleiner Zellen nahm nach 24-stündiger Paracetamol-Exposition signifikant zu, während ausgebreitete Zellen bereits nach einer Stunde eine verminderte Direktheit zeigten.
