Este protocolo se dirige al limitado problema de suministro de órganos de trasplante facilitando la evaluación de diferentes estrategias de acondicionamiento cardioprotector para permitir el uso de corazones donados después de la muerte circulatoria. Coloque el animal en una almohadilla calefactora ajustada a media. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del dedo del dedo en una rata adulta anestesiada, inserte una sonda de temperatura rectal.
Conecte un sensor oxímetro de pulso transdérmico a una pata trasera y cubra a la rata con una almohadilla absorbente para mantener la temperatura corporal. Haz una incisión de piel de línea media de tres a cuatro centímetros en el cuello, y usa tijeras curvas con punta contundente para diseccionar el tejido subcutáneo, para exponer el músculo esternohiide derecho. Usando fórceps no traumáticos, mueva el músculo lateralmente hasta que se identifiquen la arteria carótida derecha, la vena yugular y el nervio vago.
Use tijeras para separar cuidadosamente el nervio vago de la arteria carótida. Inyectar 2.000 unidades internacionales por kilogramo de heparina en la vena yugular derecha, aplicando presión en el lugar de inyección después de la retracción de la aguja para evitar fugas de sangre. Utilice fórceps curvos para pasar dos suturas de seda 5-0 alrededor de la arteria carótida.
Une firmemente la sutura distal para ocluir la arteria carótida en el aspecto superior de la arteria expuesta, manteniendo la sutura proximal desatada, y coloca la rata bajo un microscopio estéreo. Luego use tijeras de microcirugía para hacer cuidadosamente una incisión de un milímetro sobre la pared anterior de la arteria carótida, e inserte un catéter intravenoso cerrado de 22 pulgadas y una pulgada hacia el arco aórtico. El uso de herramientas de aumento y microdisección es muy recomendable para estos pasos.
Un campo limpio se puede lograr tensando la sutura proximal para evitar el sangrado. La donación cardíaca es necesaria para ensamblar el aparato de cardioplegia ex vivo. Para iniciar el protocolo DCD, primero extubar al animal, luego usar fórceps de mosquito para sujetar la tráquea, iniciando la fase agonnal.
Comience a contar el INGENIO funcional cuando la presión arterial sistólica máxima cae por debajo de 30 milímetros de mercurio o asistole o fibrilación ventricular aparece, lo que ocurra primero. Al final de WIT, realice una esternotomía medial, manteniendo el tórax abierto con un retractor De Alm si es necesario. Separe el corazón de las venas pulmonares y otras estructuras torácicas para completar la cardiectomía.
Sumerja inmediatamente el corazón en una solución de Krebs helada para un transporte rápido al sistema ex vivo. Usa una sutura de seda 2-0 para fijar firmemente la aorta al aparato Langendorff, y luego abre el llave. Ahora abra completamente el flujo a la cánula, e inicie el tiempo de reperfusión y estabilización inicial.
Gire el corazón para que las aurículas estén frente al sensor de presión, y diseccione las venas pulmonares para ensanchar la abertura auricular ventricular izquierda si es necesario. A continuación, inserte un globo de látex conectado a un sensor de presión, asegurándose de que el globo esté completamente posicionado dentro del ventrículo. Llene lentamente el globo con solución salina hasta que la presión diastólica final alcance los 15 milímetros de mercurio.
Inserte el electrodo de ritmo en la cara anterior del corazón sin perforar los vasos coronarios. Una vez observado un latido espontáneo, ajuste el ritmo a 300 latidos por minuto. Después de 10 minutos de estabilización, inicie el registro continuo de medición de presión intraventricular para comenzar la fase de reacondicionamiento y evaluación.
Después de una hora, retire el corazón del aparato Langendorff y utilice una hoja de acero recto de alto carbono para eliminar las aurículas. Con el ventrículo derecho hacia abajo, corta rodajas transversas de uno a dos milímetros de espesor. Exprimir el ventrículo derecho de la tercera rebanada de tejido, y congelar el ventrículo izquierdo para análisis bioquímicos aguas abajo.
Sumerja las secciones restantes en una solución 5%TTC recién preparada en PBS durante 10 minutos a 37 grados centígrados. A la mañana siguiente, lave las muestras dos veces en PBS fresco y sumerja las muestras en PBS fresco para obtener imágenes. Los tejidos viables aparecerán de color rojo ladrillo.
Después de la extubación, la presión arterial disminuye rápidamente en un patrón predecible y el tiempo esperado hasta la muerte es de menos de cinco minutos. Aquí, se muestran las curvas de presión media frente a tiempo al inicio del reacondicionamiento después de cero, 10 y 15 minutos de WIT. La función contráctil mejorará con el tiempo, el uso de períodos cortos de WIT permitirá que la contractilidad vuelva a la normalidad, y el daño morfológico no será detectable.
El uso de un agente acondicionador añadido con la cardioplegia y en la fase de estabilización demostró que el daño generado por 15 minutos de WIT en este modelo son susceptibles de modulación por agentes cardioprotectores. Esta técnica permite un control total de todas las variables relevantes y pruebas de intervención farmacológica y no farmacológica y puede reproducirse en modelos más grandes, facilitando la traducción clínica.
