Questo protocollo si rivolge al problema della fornitura limitata di organi di trapianto facilitando la valutazione di diverse strategie di condizionamento cardioprotettivo per consentire l'uso di cuori donati dopo la morte circolatoria. Posizionare l'animale su una pastiglia di riscaldamento impostata su medio. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del dito in un ratto adulto anestetizzato, inserire una sonda di temperatura rettale.
Attaccare un sensore di ossimetro a impulsi transdermico a una zampa posteriore e coprire il topo con un cuscinetto assorbente per mantenere la temperatura corporea. Fai un'incisione della pelle della linea mediana da tre a quattro centimetri nel collo e usa forbici curve con punta smussata per smussare sezionare il tessuto sottocutaneo, per esporre il muscolo sternoioideo destro. Usando forcep nontraumatiche, spostare il muscolo lateralmente fino a identificare l'arteria carotide destra, la vena giugulare e il nervo vago.
Utilizzare le forbici per separare accuratamente il nervo vago dall'arteria carotide. Iniettare 2.000 unità internazionali per chilogrammo di eparina nella vena giugulare destra, applicando pressione al sito di iniezione dopo la retrazione dell'ago per evitare perdite di sangue. Usa le forcep curve per passare due suture di seta 5-0 intorno all'arteria carotide.
Attaccare saldamente la sutura distale per occluderla all'aspetto superiore dell'arteria esposta, mantenendo la sutura prossimale slegata, e posizionare il topo al microscopio stereo. Quindi utilizzare forbici in microchirurgia per fare con cura un'incisione di un millimetro sulla parete anteriore dell'arteria carotidea e inserire un catetere endovenoso chiuso da 22 calibri da un pollice verso l'arco aortico. L'uso di strumenti di ingrandimento e microdisezione è altamente raccomandato per questi passaggi.
Un campo pulito può essere ottenuto tensionando la sutura prossimale per evitare sanguinamenti. La donazione cardiaca è necessaria per assemblare l'apparato cardioplegia ex vivo. Per avviare il protocollo DCD, prima estortiare l'animale, quindi utilizzare pinze di zanzara per bloccare la trachea, iniziando la fase agonale.
Inizia a contare l'ARG funzionale quando la pressione sanguigna sistolica di picco scende sotto i 30 millimetri di mercurio o appare asstolo o fibrillazione ventricolare, a seconda di quale viene prima. Alla fine di WIT, eseguire una sternotomia mediale, mantenendo il torace aperto con un riavvolgitore Alm, se necessario. Separare il cuore dalle vene polmonari e da altre strutture toraciche per completare la cardiectomia.
Immergere immediatamente il cuore nella soluzione Krebs ghiacciata per un rapido trasporto al sistema ex vivo. Usa una sutura di seta 2-0 per fissare saldamente l'aorta all'apparato di Langendorff, quindi apri il fermapetto. Ora apri completamente il flusso alla cannula e inizia il tempo iniziale di riperfusione e stabilizzazione.
Ruotare il cuore in modo che l'atri sia rivolto verso il sensore di pressione e sezionare le vene polmonari per allargare l'apertura atriale ventricolare sinistra, se necessario. Quindi, inserire un palloncino in lattice collegato a un sensore di pressione, assicurandosi che il palloncino sia completamente posizionato all'interno del ventricolo. Riempire lentamente il palloncino con salina fino a quando la pressione diastolica finale raggiunge i 15 millimetri di mercurio.
Inserire l'elettrodo di stimolazione nella faccia anteriore del cuore senza forare i vasi coronari. Una volta osservato il pestaggio spontaneo, impostare il ritmo su 300 battiti al minuto. Dopo 10 minuti di stabilizzazione, avviare la registrazione continua della misurazione della pressione intraventricolare per iniziare la fase di ricondizionamento e valutazione.
Dopo un'ora, rimuovere il cuore dall'apparato di Langendorff e utilizzare una lama dritta in acciaio ad alto tenore di carbonio per rimuovere gli atri. Con il ventricolo destro rivolto verso il basso, tagliare fette ventricolari trasversali spesse da uno a due millimetri. Asportare il ventricolo destro dalla terza fetta di tessuto e congelare il ventricolo sinistro per analisi biochimiche a valle.
Immergere le sezioni rimanenti in soluzione 5%TTC preparata al momento in PBS per 10 minuti a 37 gradi Celsius. La mattina seguente, lavare i campioni due volte in PBS fresco e immergere i campioni in PBS fresco per l'imaging. I tessuti vitali appariranno di colore rosso mattone.
Dopo l'estolazione, la pressione sanguigna scende rapidamente in un modello prevedibile e il tempo previsto per morire è inferiore a cinque minuti. Qui vengono mostrate le curve di pressione media rispetto al tempo all'inizio del ricondizionamento dopo zero, 10 e 15 minuti di WIT. La funzione contrattile migliorerà nel tempo, l'uso di brevi periodi di WIT consentirà alla contrattilità di tornare alla normalità e i danni morfologici non saranno rilevabili.
L'uso di un agente condizionante aggiunto con la cardioplegia e in fase di stabilizzazione ha dimostrato che i danni generati da 15 minuti di WIT in questo modello sono suscettibili di modulazione da parte di agenti cardioprotettivi. Questa tecnica consente il pieno controllo di tutte le variabili rilevanti e dei test di intervento farmacologico e non farmaceutico e può essere riprodotta in modelli più grandi, facilitando la traduzione clinica.
