Este protocolo es adecuado para la investigación sobre los diversos aspectos y los resultados del dolor por quemaduras y su tratamiento, y se espera que aporte información importante a este campo de investigación. Este protocolo establece un modelo animal de quemaduras inducidas por agua caliente y propone un método para medir el dolor relacionado, las alteraciones de la marcha y las respuestas conductuales similares a la depresión. Demostrando el procedimiento estará Jaehyuk Kim, un estudiante de maestría en el laboratorio del Dr. Kim.
Para comenzar, aloje a los ratones ICR machos que pesan de 20 a 25 gramos en una habitación con luz y temperatura controlada. Permita que los ratones tengan libre acceso a alimentos y agua y aclimatarse durante al menos una semana antes del inicio del experimento. Después de una semana, asigne a los ratones al azar al grupo experimental o de control y use números de animales como códigos para realizar experimentos ciegos.
Antes de realizar la inducción de quemaduras, use una bata quirúrgica, guantes y máscara. A continuación, después de anestesiar profundamente al ratón, desinfecte alrededor de la pata trasera derecha con etanol al 70% y aplique un ungüento oftálmico en los ojos para evitar el secado corneal, luego haga una marca en el tobillo de cada ratón y sumerja la pata trasera derecha en agua caliente a 65 grados centígrados durante tres segundos. Después de la lesión por quemadura, coloque el ratón en una almohadilla térmica en una jaula doméstica limpia hasta que se recupere de la anestesia.
Lleve a los ratones a la sala de pruebas de comportamiento y déjelos aclimatarse durante al menos 30 minutos antes de la prueba. Mientras los ratones se aclimatan, póngase una bata quirúrgica, guantes y máscara. A continuación, coloque los ratones en una caja cuadrada en un piso de malla metálica y déjelos aclimatarse durante otros 30 minutos.
Luego, para evaluar el umbral mecánico de la pata trasera utilizando el método de estímulo ascendente, empuje suavemente la pata con una serie de filamentos von Frey en intervalos de cinco a ocho segundos para estimular la planta posterior. Realizar cinco ensayos para evaluar los umbrales mecánicos para cada pata trasera ipsilateral. Para el análisis de la marcha, aclimate a los ratones en el sistema de análisis de la marcha diariamente durante 10 a 15 minutos a partir de cinco días antes de la lesión por quemadura.
El día de la prueba, después de usar bata quirúrgica, guantes y máscara, lleve a los ratones a la sala de pruebas de comportamiento y déjelos aclimatarse durante 30 minutos antes de la prueba, luego inicie el programa de análisis de la marcha y haga clic en el menú Crear nuevo experimento para designar la carpeta para guardar los datos. Después de la designación, establezca el tiempo máximo de ejecución en cinco segundos y las variaciones de velocidad máximas permitidas en 50%A continuación, en la pestaña de configuración del programa, seleccione una cámara registrada y establezca la longitud de la pasarela en 30 centímetros. Luego, en la pestaña adquirida del menú del programa, seleccione abrir adquisición y, según los mensajes de estado, haga clic en el botón de fondo de ajuste para adquirir una imagen de fondo de una pasarela vacía.
A continuación, haga clic en el botón de inicio de adquisición y coloque el mouse en la entrada de la pasarela transitable izquierda / derecha. La grabación se iniciará automáticamente siguiendo el movimiento libre del ratón. Después de una grabación exitosa, seleccione clasificar las ejecuciones en la pestaña adquirida del menú del programa, luego seleccione la ejecución que se analizará y haga clic en el botón de clasificación automática.
Una vez completada la clasificación automática, elimine la nariz, el reconocimiento genital y el reconocimiento incorrecto de las patas a los datos basura en cada carrera, luego analice los datos. Después de un período de aclimatación de 30 minutos en la sala de pruebas de comportamiento, coloque al ratón en un cilindro de plexiglás transparente que contenga 15 centímetros de agua durante 15 minutos. Al día siguiente, coloque el ratón en el cilindro nuevamente en las mismas condiciones y mida el tiempo de inmovilidad, es decir, cuando el ratón deja de trepar o nadar y simplemente flota con la cabeza sobre la superficie del agua.
A continuación, para medir la función motora normal, coloque al animal en una plataforma cilíndrica rodante suspendida a 16 centímetros por encima de la parte inferior del aparato. Antes de inducir lesiones por quemaduras, permita que los ratones entrenen una vez al día en la varilla giratoria durante al menos cinco días. Después de la administración del medicamento, realice una prueba de rotarod cada 20 minutos durante dos horas con un tiempo de corte de dos minutos.
Mida la duración del tiempo que el ratón funciona en una varilla giratoria a la velocidad constante de 15 revoluciones por minuto sin caer. El umbral de retirada de la pata de los ratones inducidos por quemaduras disminuyó después del primer día y se mantuvo durante siete días en comparación con el grupo de control. La administración de paracetamol redujo significativamente la disminución inducida por quemaduras en el umbral de extracción de la pata.
Además, el área bajo el análisis de la curva mostró que la administración de paracetamol disminuyó significativamente la alodinia mecánica inducida por lesiones por quemaduras. El área de impresión de la pata trasera también se redujo significativamente después de la inducción de la lesión por quemadura y persistió durante siete días. La administración de paracetamol mejoró significativamente el área de impresión de la pata trasera en comparación con el tratamiento del vehículo.
Además, la lesión por quemadura redujo la postura única de la pata trasera ipsilateral después del primer día y esta reducción se mantuvo durante siete días. La postura única de la pata trasera fue mejorada por la administración de paracetamol. En la prueba de natación forzada, los tiempos de inmovilidad de los ratones inducidos por quemaduras aumentaron siete días después de la lesión en comparación con los del grupo de control.
La administración de paracetamol redujo significativamente el aumento inducido por la lesión por quemaduras en el tiempo de inmovilidad. En la prueba de rotarod, los tiempos de ejecución de los ratones inducidos por lesiones por quemaduras fueron similares a los del grupo de control siete días después de la inducción de quemaduras. En contraste, los tiempos de ejecución de los ratones tratados con alfaxolona disminuyeron significativamente en aproximadamente 60 minutos, lo que indica que este método de lesión por quemaduras no causa deterioro motor.
La extensión de la quemadura aplicada a cada animal debe mantenerse constante para obtener resultados precisos. Los diversos métodos de análisis experimental conductual propuestos en este estudio también se pueden aplicar a otros modelos animales relacionados con el dolor, la alteración de la marcha y el comportamiento similar a la depresión. Los métodos de análisis propuestos pueden cuantificar varios síntomas después de la inducción de la lesión por quemadura, lo que será útil para el desarrollo de métodos de investigación y tratamiento relacionados con las quemaduras en el futuro.
