Dieses Protokoll eignet sich für die Erforschung der verschiedenen Aspekte und der Ergebnisse von Verbrennungsschmerzen und deren Behandlung und soll wichtige Informationen in dieses Forschungsfeld einbringen. Dieses Protokoll etabliert ein durch heißes Wasser induziertes Verbrennungstiermodell und schlägt eine Methode zur Messung verwandter Schmerzen, Gangstörungen und depressionsähnlicher Verhaltensreaktionen vor. Das Verfahren wird von Jaehyuk Kim, einem Meisterschüler in Dr. Kims Labor, demonstriert.
Unterbringen Sie zunächst die männlichen ICR-Mäuse mit einem Gewicht von 20 bis 25 Gramm in einem leichten und temperaturgesteuerten Raum. Erlauben Sie den Mäusen, freien Zugang zu Nahrung und Wasser zu haben und sich mindestens eine Woche vor Beginn des Experiments zu akklimatisieren. Nach einer Woche ordnen Sie die Mäuse nach dem Zufallsprinzip der Versuchs- oder Kontrollgruppe zu und verwenden Tiernummern als Codes für die Durchführung blinder Experimente.
Bevor Sie die Verbrennungsinduktion durchführen, tragen Sie ein OP-Kittel, Handschuhe und eine Maske. Als nächstes, nach der Tiefenbetäubung der Maus, desinfizieren Sie um die rechte Hinterpfote mit 70% Ethanol und tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um das Austrocknen der Hornhaut zu verhindern, dann machen Sie eine Markierung auf dem Knöchel jeder Maus und tauchen Sie die rechte Hinterpfote in heißes Wasser bei 65 Grad Celsius für drei Sekunden. Legen Sie die Maus nach der Brandverletzung auf ein Heizkissen in einem sauberen Hauskäfig, bis sie sich von der Anästhesie erholt.
Bringen Sie die Mäuse in den Verhaltenstestraum und lassen Sie sie sich vor dem Test mindestens 30 Minuten lang akklimatisieren. Während sich die Mäuse akklimatisieren, ziehen Sie ein OP-Kittel, Handschuhe und eine Maske an. Als nächstes legen Sie die Mäuse in eine quadratische Box auf einem Metallgitterboden und lassen Sie sie für weitere 30 Minuten akklimatisieren.
Um dann die mechanische Schwelle der Hinterpfote mit der aufsteigenden Reizmethode zu beurteilen, stechen Sie die Pfote vorsichtig mit einer Reihe von Von-Frey-Filamenten in Fünf- bis Acht-Sekunden-Intervallen, um den Hinterplantar zu stimulieren. Führen Sie fünf Versuche durch, um mechanische Schwellenwerte für jede ipsilaterale Hinterpfote zu bewerten. Für die Ganganalyse akklimatisieren Sie die Mäuse im Ganganalysesystem täglich für 10 bis 15 Minuten, beginnend fünf Tage vor der Brandverletzung.
Bringen Sie am Testtag, nachdem Sie OP-Kittel, Handschuhe und Maske getragen haben, die Mäuse in den Verhaltenstestraum und lassen Sie sie sich vor dem Test 30 Minuten lang akklimatisieren, starten Sie dann das Ganganalyseprogramm und klicken Sie auf das Menü Neues Experiment erstellen, um den Ordner zum Speichern der Daten festzulegen. Stellen Sie nach der Benennung die maximale Laufzeit auf fünf Sekunden und die maximal zulässigen Geschwindigkeitsschwankungen auf 50% ein. Wählen Sie als Nächstes auf der Registerkarte Setup des Programms eine registrierte Kamera aus und legen Sie die Gehweglänge auf 30 Zentimeter fest. Wählen Sie dann auf der Registerkarte Erfasst des Programmmenüs die Option Aufnahme öffnen und klicken Sie basierend auf den Statusmeldungen auf die Schaltfläche Hintergrund ausrichten, um ein Hintergrundbild eines leeren Gehwegs zu erhalten.
Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche zum Starten der Erfassung und platzieren Sie die Maus am Eingang des links/rechts quer verlaufenden Gehwegs. Die Aufzeichnung startet automatisch nach der freien Bewegung der Maus. Wählen Sie nach einer erfolgreichen Aufzeichnung auf der Registerkarte Erfasst des Programmmenüs die Option Läufe klassifizieren aus, wählen Sie dann den zu analysierenden Lauf aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Automatisch klassifizieren.
Nachdem die automatische Klassifizierung abgeschlossen ist, entfernen Sie Nasen-, Genitalerkennung und Fehlerkennung von Pfoten, um Daten in jedem Durchlauf zu verwerfen, und analysieren Sie dann die Daten. Nach einer 30-minütigen Akklimatisierungsphase im Verhaltenstestraum legen Sie die Maus 15 Minuten lang in einen durchsichtigen Plexiglaszylinder, der 15 Zentimeter Wasser enthält. Am nächsten Tag legen Sie die Maus unter den gleichen Bedingungen wieder in den Zylinder und messen die Immobilitätszeit, dh wenn die Maus aufhört zu klettern oder zu schwimmen und nur mit dem Kopf über der Wasseroberfläche schwebt.
Um die normale motorische Funktion zu messen, legen Sie das Tier als nächstes auf eine rollende zylindrische Plattform, die 16 Zentimeter über der Unterseite des Geräts aufgehängt ist. Bevor Sie eine Brandverletzung verursachen, lassen Sie die Mäuse mindestens fünf Tage lang einmal täglich auf dem Rotarod trainieren. Führen Sie nach der Verabreichung des Arzneimittels alle 20 Minuten für zwei Stunden einen Rotarod-Test mit einer Cutoff-Zeit von zwei Minuten durch.
Messen Sie die Zeitdauer, die die Maus auf einem rotierenden Stab mit der konstanten Geschwindigkeit von 15 Umdrehungen pro Minute läuft, ohne zu fallen. Die Pfotenentzugsschwelle von durch Verbrennungsverletzungen induzierten Mäusen nahm nach dem ersten Tag ab und wurde im Vergleich zur Kontrollgruppe sieben Tage lang aufrechterhalten. Die Verabreichung von Acetaminophen reduzierte signifikant die verbrennungsbedingte Abnahme der Pfotenentzugsschwelle.
Darüber hinaus zeigte der Bereich unter der Kurvenanalyse, dass die Verabreichung von Paracetamol die durch Verbrennungsverletzungen induzierte mechanische Allodynie signifikant verringerte. Der Hinterpfotenabdruckbereich reduzierte sich auch nach der Induktion einer Brandverletzung signifikant und blieb sieben Tage lang bestehen. Die Verabreichung von Acetaminophen verbesserte den Hinterpfotenabdruckbereich im Vergleich zur Fahrzeugbehandlung signifikant.
Darüber hinaus reduzierte die Brandverletzung die einzelne Haltung der ipsilateralen Hinterpfote nach dem ersten Tag und diese Verringerung wurde sieben Tage lang beibehalten. Die Einzelhaltung der Hinterpfote wurde durch die Gabe von Paracetamol verbessert. Im erzwungenen Schwimmtest waren die Immobilitätszeiten der durch Verbrennungsverletzungen verursachten Mäuse sieben Tage nach der Verletzung im Vergleich zu denen der Kontrollgruppe erhöht.
Die Verabreichung von Acetaminophen reduzierte signifikant die durch Verbrennungsverletzungen verursachte Zunahme der Immobilitätszeit. Im Rotarod-Test waren die Laufzeiten der durch Verbrennungsverletzungen verursachten Mäuse ähnlich denen der Kontrollgruppe sieben Tage nach der Brandinduktion. Im Gegensatz dazu wurden die Laufzeiten von mit Alphaxolon behandelten Mäusen signifikant um etwa 60 Minuten reduziert, was darauf hindeutet, dass diese Verbrennungsverletzungsmethode keine motorischen Beeinträchtigungen verursacht.
Das Ausmaß der Verbrennung, die auf jedes Tier angewendet wird, muss konstant gehalten werden, um genaue Ergebnisse zu erhalten. Die verschiedenen verhaltensexperimentellen Analysemethoden, die in dieser Studie vorgeschlagen werden, können auch auf andere Tiermodelle angewendet werden, die sich auf Schmerzen, Gangstörungen und depressionsähnliches Verhalten beziehen. Die vorgeschlagenen Analysemethoden können verschiedene Symptome nach der Induktion von Verbrennungsverletzungen quantifizieren, was für die Entwicklung von verbrennungsbezogenen Forschungs- und Behandlungsmethoden in der Zukunft hilfreich sein wird.
