Este protocolo é adequado para pesquisas sobre os diversos aspectos e os resultados da dor de queimadura e seu tratamento, e espera-se que traga informações importantes para este campo de pesquisa. Este protocolo estabelece um modelo animal queimado induzido pela água quente e propõe um método para medir dor relacionada, distúrbios de marcha e respostas comportamentais semelhantes à depressão. Demonstrando o procedimento estará Jaehyuk Kim, um estudante de mestrado no laboratório do Dr. Kim.
Para começar, abriga os ratos machos ICR pesando de 20 a 25 gramas em uma sala controlada por luz e temperatura. Permita que os ratos tenham acesso gratuito a comida e água e aclimatar por pelo menos uma semana antes do início do experimento. Após uma semana, atribua os ratos aleatoriamente ao grupo experimental ou controle e use números de animais como códigos para a realização de experimentos cegos.
Antes de realizar a indução de queimadura, use um vestido cirúrgico, luvas e máscara. Em seguida, depois de anestesiar profundamente o rato, desinfete ao redor da pata traseira direita com 70% de etanol e aplique uma pomada oftalmômica nos olhos para evitar a secagem da córnea, em seguida, faça uma marca no tornozelo de cada rato e mergulhe a pata traseira direita em água quente a 65 graus Celsius por três segundos. Após a lesão da queimadura, coloque o rato em uma almofada de aquecimento em uma gaiola limpa até que ele se recupere da anestesia.
Leve os ratos para a sala de testes comportamentais e deixe-os aclimatar por pelo menos 30 minutos antes do teste. Enquanto os ratos se aclimatam, coloque um vestido cirúrgico, luvas e máscara. Em seguida, coloque os ratos em uma caixa quadrada em um piso de malha de metal e deixe-os aclimatar por mais 30 minutos.
Em seguida, para avaliar o limiar mecânico da pata traseira usando o método de estímulo ascendente, pique suavemente a pata com uma série de filamentos Von Frey em intervalos de cinco a oito segundos para estimular o plantar traseiro. Realize cinco ensaios para avaliar limiares mecânicos para cada pata traseira ipsilateral. Para análise de marcha, aclimatar os camundongos no sistema de análise de marcha diariamente por 10 a 15 minutos, começando cinco dias antes da lesão da queimadura.
No dia do teste, depois de usar vestido cirúrgico, luvas e máscara, leve os ratos para a sala de teste comportamental e deixe-os aclimatar por 30 minutos antes do teste, em seguida, iniciar o programa de análise de marcha e clicar no novo menu de experimento para designar a pasta para salvar os dados. Após a designação, defina o tempo máximo de execução para cinco segundos e as variações máximas de velocidade permitidas para 50% Em seguida, na guia de configuração do programa, selecione uma câmera registrada e defina o comprimento da passarela para 30 centímetros. Em seguida, na guia adquirida do menu do programa, selecione a aquisição aberta e com base nas mensagens de status, clique no botão de fundo snap para adquirir uma imagem de fundo de uma passarela vazia.
Em seguida, clique no botão de aquisição iniciar e coloque o mouse na entrada da passarela transversível esquerda/direita. A gravação começará automaticamente após a livre circulação do mouse. Após uma gravação bem-sucedida, selecione classificar corridas a partir da guia adquirida do menu do programa e selecione a execução a ser analisada e clique no botão de classificação automática.
Após a classificação automática ser concluída, remova o nariz, o reconhecimento genital e o equívoco das patas para os dados de lixo em cada execução e, em seguida, analise os dados. Após um período de aclimatação de 30 minutos na sala de teste comportamental, coloque o mouse em um cilindro plexiglas claro contendo 15 centímetros de água por 15 minutos. No dia seguinte, coloque o rato no cilindro novamente sob as mesmas condições e meça o tempo de imobilidade, que é quando o rato pára de subir ou nadar e apenas flutua com a cabeça acima da superfície da água.
Em seguida, para medir a função motora normal, coloque o animal em uma plataforma cilíndrica de rolamento suspensa 16 centímetros acima da parte inferior do aparelho. Antes de induzir lesões de queimadura, permita que os ratos treinem uma vez por dia na rotarod por pelo menos cinco dias. Após a administração de drogas, realize um teste rotarod a cada 20 minutos por duas horas com um tempo de corte de dois minutos.
Meça a duração do tempo que o mouse corre em uma haste giratória na velocidade constante de 15 rotações por minuto sem cair. O limiar de retirada da pata de camundongos induzidos por queimaduras diminuiu após o primeiro dia e foi mantido por sete dias em comparação com o grupo controle. A administração de acetaminofeno reduziu significativamente a diminuição induzida por queimaduras no limiar de retirada da pata.
Além disso, a área sob a análise da curva mostrou que a administração de acetaminofeno diminuiu significativamente a aodínia mecânica induzida por lesões por queimaduras. A área de impressão da pata traseira também reduziu significativamente após a indução da queimadura e persistiu por sete dias. A administração de acetaminofeno melhorou significativamente a área de impressão da pata traseira em comparação com o tratamento do veículo.
Além disso, a lesão por queimadura reduziu a postura única da pata traseira ipsilateral após o primeiro dia e essa redução foi mantida por sete dias. A posição de pata traseira foi melhorada pela administração do acetaminofeno. No teste de natação forçada, os tempos de imobilidade dos camundongos induzidos por queimaduras foram aumentados sete dias após a lesão em comparação com os do grupo controle.
A administração de acetaminofeno reduziu significativamente o aumento induzido por queimaduras no tempo de imobilidade. No teste rotarod, os tempos de execução dos camundongos induzidos por queimaduras foram semelhantes aos do grupo controle sete dias após a indução da queimadura. Em contraste, os tempos de funcionamento dos camundongos tratados com alfaxolone foram significativamente reduzidos em cerca de 60 minutos, indicando que este método de lesão por queimadura não causa prejuízo motor.
A extensão da queimadura aplicada a cada animal deve ser mantida constante para obter resultados precisos. Os vários métodos de análise experimental comportamental propostos neste estudo também podem ser aplicados a outros modelos animais relacionados à dor, perturbação da marcha e comportamento semelhante à depressão. Os métodos de análise propostos podem quantificar vários sintomas após a indução de lesão por queimadura, o que será útil para o desenvolvimento de métodos de pesquisa e tratamento relacionados à queimadura no futuro.
