Questo protocollo è adatto per la ricerca sui vari aspetti e gli esiti del dolore da ustione e del suo trattamento, e si prevede che porterà informazioni importanti a questo campo di ricerca. Questo protocollo stabilisce un modello animale di ustione indotto dall'acqua calda e propone un metodo per misurare il dolore correlato, i disturbi dell'andatura e le risposte comportamentali simili alla depressione. A dimostrare la procedura sarà Jaehyuk Kim, uno studente master nel laboratorio del Dr.Kim.
Per iniziare, ospita i topi ICR maschi del peso di 20-25 grammi in una stanza luminosa e a temperatura controllata. Consenti ai topi di avere libero accesso al cibo e all'acqua e acclimatarsi per almeno una settimana prima dell'inizio dell'esperimento. Dopo una settimana, assegna i topi in modo casuale al gruppo sperimentale o di controllo e usa i numeri degli animali come codici per condurre esperimenti ciechi.
Prima di eseguire l'induzione dell'ustione, indossare un camice chirurgico, guanti e maschera. Successivamente, dopo aver anestetizzato profondamente il topo, disinfettare intorno alla zampa posteriore destra con etanolo al 70% e applicare un unguento oftalmico agli occhi per prevenire l'essiccazione corneale, quindi fare un segno sulla caviglia di ciascun topo e immergere la zampa posteriore destra in acqua calda a 65 gradi Celsius per tre secondi. Dopo la lesione da ustione, posizionare il mouse su una piastra riscaldante in una gabbia domestica pulita fino a quando non si riprende dall'anestesia.
Porta i topi nella sala di test comportamentali e lasciali acclimatare per almeno 30 minuti prima del test. Mentre i topi si acclimatano, indossa un camice chirurgico, guanti e maschera. Quindi, posizionare i topi in una scatola quadrata su un pavimento in rete metallica e lasciarli acclimatare per altri 30 minuti.
Quindi, per valutare la soglia meccanica della zampa posteriore usando il metodo dello stimolo ascendente, colpire delicatamente la zampa con una serie di filamenti di Von Frey a intervalli da cinque a otto secondi per stimolare il plantare posteriore. Eseguire cinque prove per valutare le soglie meccaniche per ogni zampa posteriore ipsilaterale. Per l'analisi dell'andatura, acclimatare i topi nel sistema di analisi dell'andatura ogni giorno per 10-15 minuti a partire da cinque giorni prima della lesione da ustione.
Il giorno del test, dopo aver indossato camice chirurgico, guanti e maschera, porta i topi nella sala test comportamentale e lasciali acclimatare per 30 minuti prima del test, quindi avvia il programma di analisi dell'andatura e fai clic sul menu Crea nuovo esperimento per designare la cartella in cui salvare i dati. Dopo la designazione, impostare il tempo di esecuzione massimo su cinque secondi e le variazioni di velocità massime consentite su 50%Successivamente, nella scheda di configurazione del programma, selezionare una fotocamera registrata e impostare la lunghezza della passerella su 30 centimetri. Quindi nella scheda acquisita del menu del programma, selezionare l'acquisizione aperta e in base ai messaggi di stato, fare clic sul pulsante di sfondo a scatto per acquisire un'immagine di sfondo di una passerella vuota.
Quindi, fare clic sul pulsante di avvio dell'acquisizione e posizionare il mouse all'ingresso della passerella trasversale sinistra / destra. La registrazione inizierà automaticamente seguendo il libero movimento del mouse. Dopo una registrazione riuscita, selezionare classifica esecuzioni dalla scheda acquisita del menu del programma, quindi selezionare l'esecuzione da analizzare e fare clic sul pulsante di classificazione automatica.
Una volta completata la classificazione automatica, rimuovere il naso, il riconoscimento genitale e il riconoscimento errato delle zampe ai dati spazzatura in ogni corsa, quindi analizzare i dati. Dopo un periodo di acclimatazione di 30 minuti nella sala di test comportamentale, posizionare il mouse in un cilindro di plexiglas trasparente contenente 15 centimetri di acqua per 15 minuti. Il giorno dopo, metti di nuovo il mouse nel cilindro nelle stesse condizioni e misura il tempo di immobilità, cioè quando il mouse smette di arrampicarsi o nuotare e galleggia con la testa sopra la superficie dell'acqua.
Successivamente, per misurare la normale funzione motoria, posizionare l'animale su una piattaforma cilindrica rotante sospesa a 16 centimetri sopra il fondo dell'apparecchio. Prima di indurre lesioni da ustione, consentire ai topi di allenarsi una volta al giorno sul rotarod per almeno cinque giorni. Dopo la somministrazione del farmaco, eseguire un test rotarod ogni 20 minuti per due ore con un tempo limite di due minuti.
Misurare la durata del tempo in cui il mouse scorre su un'asta rotante alla velocità costante di 15 giri al minuto senza cadere. La soglia di ritiro della zampa dei topi indotti da ustioni è diminuita dopo il primo giorno ed è stata sostenuta per sette giorni rispetto al gruppo di controllo. La somministrazione di paracetamolo ha ridotto significativamente la diminuzione indotta da ustioni nella soglia di prelievo della zampa.
Inoltre, l'area sotto l'analisi della curva ha mostrato che la somministrazione di paracetamolo ha ridotto significativamente l'allodinia meccanica indotta da ustioni. Anche l'area di stampa della zampa posteriore si è ridotta significativamente dopo l'induzione della lesione da ustione e ha persistito per sette giorni. La somministrazione di paracetamolo ha migliorato significativamente l'area di stampa della zampa posteriore rispetto al trattamento del veicolo.
Inoltre, la lesione da ustione ha ridotto la singola posizione della zampa posteriore ipsilaterale dopo il primo giorno e questa riduzione è stata mantenuta per sette giorni. La posizione singola della zampa posteriore è stata migliorata dalla somministrazione di paracetamolo. Nel test di nuoto forzato, i tempi di immobilità dei topi indotti da ustioni sono aumentati sette giorni dopo l'infortunio rispetto a quelli del gruppo di controllo.
La somministrazione di paracetamolo ha ridotto significativamente l'aumento del tempo di immobilità indotto da ustioni. Nel test rotarod, i tempi di esecuzione dei topi indotti da ustioni erano simili a quelli del gruppo di controllo sette giorni dopo l'induzione dell'ustione. Al contrario, i tempi di esecuzione dei topi trattati con alfaxolone sono stati significativamente ridotti di circa 60 minuti, indicando che questo metodo di ustione non causa compromissione motoria.
L'entità dell'ustione applicata a ciascun animale deve essere mantenuta costante per ottenere risultati accurati. I vari metodi di analisi sperimentale comportamentale proposti in questo studio possono anche essere applicati ad altri modelli animali legati al dolore, ai disturbi dell'andatura e al comportamento simile alla depressione. I metodi di analisi proposti possono quantificare vari sintomi dopo l'induzione di lesioni da ustione, che saranno utili per lo sviluppo di metodi di ricerca e trattamento relativi alle ustioni in futuro.
