Этот протокол подходит для исследований различных аспектов и результатов ожоговой боли и ее лечения, и, как ожидается, принесет важную информацию в эту область исследований. Этот протокол устанавливает модель ожога животного, вызванную горячей водой, и предлагает метод измерения связанной с этим боли, нарушений походки и поведенческих реакций, подобных депрессии. Продемонстрировать процедуру будет Джаехюк Ким, студент магистратуры в лаборатории доктора Кима.
Для начала поместите самцов мышей ICR весом от 20 до 25 граммов в светлое и контролируемое по температуре помещение. Дайте мышам свободный доступ к пище и воде и акклиматизируйтесь в течение как минимум одной недели до начала эксперимента. Через неделю случайным образом назначьте мышей в экспериментальную или контрольную группу и используйте номера животных в качестве кодов для проведения слепых экспериментов.
Перед выполнением индукции ожога наденьте хирургический халат, перчатки и маску. Далее, после глубокого обезболивания мыши, продезинфицируйте вокруг правой задней лапы 70% этанолом и нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы, затем сделайте отметку на лодыжке каждой мыши и погрузите правую заднюю лапу в горячую воду при 65 градусах Цельсия на три секунды. После ожоговой травмы поместите мышь на грелку в чистую домашнюю клетку, пока она не оправится от анестезии.
Приведите мышей в комнату поведенческого тестирования и дайте им акклиматизироваться не менее чем за 30 минут до теста. Пока мыши акклиматизируются, надевайте хирургический халат, перчатки и маску. Затем поместите мышей в квадратную коробку на металлическом сетчатом полу и дайте им акклиматизироваться еще на 30 минут.
Затем, чтобы оценить механический порог задней лапы с помощью метода восходящего стимула, осторожно тыкайте лапу серией нитей фон Фрея с интервалом в пять-восемь секунд, чтобы стимулировать задний подошвенный. Проведите пять испытаний для оценки механических порогов для каждой ипсилатеральной задней лапы. Для анализа походки акклиматизируйте мышей в системе анализа походки ежедневно в течение 10-15 минут, начиная за пять дней до ожоговой травмы.
В день теста, надев хирургический халат, перчатки и маску, приведите мышей в комнату поведенческих тестов и дайте им акклиматизироваться за 30 минут до теста, затем запустите программу анализа походки и нажмите на меню создания нового эксперимента, чтобы назначить папку для сохранения данных. После обозначения установите максимальное время работы на пять секунд и максимально допустимые изменения скорости на 50%Далее, на вкладке настройки программы выберите зарегистрированную камеру и установите длину дорожки на 30 сантиметров. Затем на приобретенной вкладке меню программы выберите открытое получение и на основе сообщений о состоянии нажмите на кнопку привязки фона, чтобы получить фоновое изображение пустой дорожки.
Затем нажмите на кнопку запуска сбора и поместите мышь на вход в левую / правую поперечной дорожку. Запись начнется автоматически после свободного движения мыши. После успешной записи выберите классифицировать запуски на приобретенной вкладке меню программы, затем выберите прогон для анализа и нажмите кнопку автоклассификации.
После того, как автоматическая классификация будет завершена, удалите нос, генитальное распознавание и неправильное распознавание лап для мусорных данных в каждом прогоне, затем проанализируйте данные. После 30-минутного периода акклиматизации в комнате поведенческих тестов поместите мышь в прозрачный цилиндр из оргстекла, содержащий 15 сантиметров воды, в течение 15 минут. На следующий день поместите мышь в цилиндр снова в тех же условиях и измерьте время неподвижности, то есть когда мышь перестает лазать или плавать и просто плавает головой над поверхностью воды.
Далее, чтобы измерить нормальную двигательную функцию, поместите животное на прокатную цилиндрическую платформу, подвешенную на 16 сантиметров над дном аппарата. Прежде чем вызвать ожоговую травму, позвольте мышам тренироваться один раз в день на ротароде в течение не менее пяти дней. После введения препарата выполняйте ротарод-тест каждые 20 минут в течение двух часов со временем отсечения в две минуты.
Измерьте продолжительность времени, в течение которого мышь работает на вращающемся стержне с постоянной скоростью 15 оборотов в минуту без падения. Порог отмены лапы у мышей, вызванных ожоговой травмой, снизился после первого дня и сохранялся в течение семи дней по сравнению с контрольной группой. Введение ацетаминофена значительно снижало вызванное ожогом снижение порога отмены лапы.
Кроме того, область под анализом кривой показала, что введение ацетаминофена значительно уменьшало механическую аллодинию, вызванную ожоговой травмой. Область отпечатка задней лапы также значительно уменьшилась после индукции ожоговой травмы и сохранялась в течение семи дней. Введение ацетаминофена значительно улучшило область отпечатка задней лапы по сравнению с лечением транспортного средства.
Кроме того, ожоговая травма уменьшила одиночное положение ипсилатеральной задней лапы после первого дня, и это снижение сохранялось в течение семи дней. Одиночная стойка задней лапы была улучшена введением ацетаминофена. В тесте на принудительное плавание время неподвижности мышей, вызванных ожоговой травмой, было увеличено через семь дней после травмы по сравнению с контрольной группой.
Введение ацетаминофена значительно уменьшало вызванное ожоговой травмой увеличение времени неподвижности. В тесте на ротарод время работы мышей, вызванных ожоговой травмой, было аналогично времени контрольной группы через семь дней после индукции ожога. Напротив, время работы мышей, получавших альфаксолон, было значительно уменьшено примерно на 60 минут, что указывает на то, что этот метод ожоговой травмы не вызывает двигательных нарушений.
Степень ожога, нанесенного на каждое животное, должна быть постоянной для получения точных результатов. Различные методы поведенческого экспериментального анализа, предложенные в этом исследовании, также могут быть применены к другим моделям животных, связанным с болью, нарушением походки и депрессивным поведением. Предлагаемые методы анализа могут количественно определять различные симптомы после индукции ожоговой травмы, что будет полезно для развития связанных с ожогом исследований и методов лечения в будущем.
