Para los pacientes diagnosticados con tumores sólidos de mama o páncreas, existe una fuerte correlación entre los eventos de progresión de la enfermedad, como la metástasis o la resistencia al tratamiento, y los malos resultados. Se sabe que los mecanismos moleculares celulares que gobiernan la homeostasis y la fibrosis de los tejidos también controlan la progresión de los tumores sólidos. Mi laboratorio está interesado en comprender estos mecanismos para que podamos desarrollar mejores terapias y medidas diagnósticas para ayudar a los pacientes.
Uno de los principales desafíos experimentales es que existe una necesidad crítica de modelos de cáncer en 3D que puedan capturar las interacciones intercelulares durante los procesos fisiológicos y fisiopatológicos, y luego, al comprender estas interacciones, se pueden comprender conocimientos adicionales sobre las enfermedades para luego desarrollar nuevas estrategias de tratamiento. Nuestro protocolo proporcionará un método de cultivo celular en 3D rentable y reproducible que replica las características del microambiente tisular in vivo. Nuestro protocolo proporcionará métodos de cultivo celular 3D fáciles y rápidos, sin andamios y basados en andamios, en los que podremos cuantificar interacciones celulares heterogéneas.
Hemos descubierto una forma de formular de manera eficiente cultivos de esferoides en 3D que se pueden usar con modelos sin andamios, pero también se pueden fusionar con sistemas basados en andamios para medir la invasión y el comportamiento de las células. Para comenzar, encienda la luz ultravioleta para desinfectar el interior del gabinete de bioseguridad durante 15 minutos. Abra la hoja de la ventana del gabinete de bioseguridad para estabilizar el flujo de aire y encienda el sistema de aspiración al vacío.
Limpie la superficie interior del capó y el tubo del sistema de aspiración al vacío con etanol al 70%. Calentar el medio de cultivo celular, PBS y EDTA al 0,25% de tripsina a 37 grados centígrados en un baño de perlas. Ahora, examine las células bajo un microscopio para confirmar una confluencia del 70 al 80%.
Usando un aspirador de vacío, aspire y deseche el medio de cultivo de las celdas plachadas. Lave el medio restante una vez con dos mililitros de PBS, luego aspire y deseche el PBS después del lavado. A continuación, con una micropipeta, añada un mililitro de tripsina a la placa de cultivo celular y coloque la placa dentro de una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados durante cinco minutos.
Ahora, agregue un mililitro de inhibidor de tripsina de soja en PBS al plato para inactivar la tripsina. Para dispersar los grupos de células, pipetee la mezcla líquida con una micropipeta P-1000. Recoja la suspensión de celdas de la parte inferior de la placa y transfiérala a un tubo cónico de 15 mililitros.
Centrifugar el tubo a 100 g durante cinco minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante con el aspirador de vacío. Deje que las sondas fluorescentes moleculares se calienten a temperatura ambiente durante 15 minutos en un baño de perlas templado a 37 grados centígrados. Con una micropipeta, vuelva a suspender las células en dos mililitros de las respectivas soluciones de medios colorantes del seguidor de células de trabajo.
Incubar los tubos a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5%. Después de 30 minutos de incubación, centrifugar los tubos a 100 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego, use un aspirador de vacío para aspirar y desechar el sobrenadante.
Vuelva a suspender el pellet completamente en un mililitro de DMEM al 10% que contiene FBS utilizando una micropipeta. Ahora, recoja 10 microlitros de la suspensión celular y transfiérala a un microtubo que contenga un volumen igual de azul de tripán. Después de mezclar las células, agregue 20 microlitros de la solución de tripán celular a un portaobjetos de la cámara de recuento de células.
Inserte la diapositiva en un contador de celdas automatizado para determinar el número de celda. Calcule el número total promedio de células vivas a partir de dos lecturas. Prepare las existencias de celdas de trabajo para cada tipo de celda a una concentración de 6,67 por 10 a la potencia de tres celdas por mililitro, lo que equivale a 2.000 celdas por 300 microlitros.
Con una micropipeta, transfiera el volumen necesario para tres réplicas técnicas más una adicional a un microtubo. Después de mezclar bien con una pipeta, transfiera 300 microlitros de la muestra a un pocillo de una microplaca de 96 pocillos de fijación ultra baja con fondo en forma de U. Coloque la placa de 96 pocillos en una incubadora a 37 grados centígrados.
Imagen del crecimiento y la morfología de los esferoides cada 24 horas, hasta 96 horas, utilizando un microscopio de contraste de fases. Encienda los dispositivos de imágenes e incubadora automatizada. Cree un nuevo protocolo de imágenes en el administrador de tareas del software de imágenes para capturar el crecimiento de 48 horas de esferoides BT-474 cocultivados con fibroblastos BJ-5ta y células endoteliales EA.hy926 teñidas con los tintes de azul, naranja y rojo intenso del rastreador de células respectivamente.
Llene una cubeta de hielo con hielo para mantener fría la solución de extracto de membrana basal y coloque la solución en hielo. Con una pipeta multicanal, aspire aproximadamente 170 microlitros de medio de la placa de cultivo. Consigue una lupa y una mini caja de luz para observar de cerca a los pequeños esferoides.
Coloque la placa esferoide de 96 pocillos sobre la caja de luz y coloque la lupa en lo alto. Ajuste una pipeta P-200 a 30 microlitros y recoja el extracto de la membrana basal para crear tres microgotas. Asegúrese de que la placa de 96 pocillos esté plana y coloque la pipeta verticalmente sobre el esferoide.
Ahora, suelta la gota sin tocar el fondo del pozo. Coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Después de la incubación, superponga los esferoides con 50 microlitros adicionales de la solución de extracto de membrana basal por pocillo e incube la placa a 37 grados centígrados durante 30 minutos.
A continuación, con una micropipeta, añada 100 microlitros de medio de cultivo celular a cada pocillo. A las 72 horas después de la siembra, las células MCF-10A, MCF-10Ca1H y BT-474 cocultivadas con EA.hy926 y THP-1 o con BJ5-ta y THP-1 mostraron un aumento significativo en el área de esferoides en comparación con los esferoides epiteliales de monocultivo. Por el contrario, las células MDA-MB-468 cocultivadas mostraron una disminución significativa en el área esferoide en comparación con el monocultivo.
La aplicación del colorante rastreador celular a las células epiteliales tumorigénicas BT-474 y a las células estromales antes del establecimiento de los esferoides, demostró que las células estromales, incluidas EA.hy926 y BJ-5ta, formaron las estructuras en ciernes en el perímetro de los esferoides centrales BT-474. A las 24 horas después de la siembra, se superpuso una membrana basal sobre células epiteliales tumorigénicas BT-474 cocultivadas con células estromales, lo que demostró la formación de estructuras invasivas.
