Enregistrement de l’activité du réseau dans les circuits nociceptifs rachidiens à l’aide de réseaux de microélectrodes

Résumé

L’utilisation combinée de la technologie des réseaux de microélectrodes et de la stimulation chimique induite par la 4-aminopyridine pour étudier l’activité nociceptive au niveau du réseau dans la corne dorsale de la moelle épinière est décrite.

Résumé

Les rôles et la connectivité de types spécifiques de neurones dans la corne dorsale de la moelle épinière (DH) sont délimités à un rythme rapide pour fournir une vue de plus en plus détaillée des circuits qui sous-tendent le traitement de la douleur vertébrale. Cependant, les effets de ces connexions sur l’activité plus large du réseau dans la DH restent moins bien compris car la plupart des études se concentrent sur l’activité de neurones uniques et de petits microcircuits. Alternativement, l’utilisation de réseaux de microélectrodes (MEA), qui peuvent surveiller l’activité électrique à travers de nombreuses cellules, fournit une résolution spatiale et temporelle élevée de l’activité neuronale. Ici, l’utilisation d’AME avec des tranches de moelle épinière de souris pour étudier l’activité de la DH induite par la stimulation chimique des circuits de DH avec la 4-aminopyridine (4-AP) est décrite. L’activité rythmique résultante est limitée à la DH superficielle, stable dans le temps, bloquée par la tétrodotoxine, et peut être étudiée dans différentes orientations de tranches. Ensemble, cette préparation fournit une plate-forme pour étudier l’activité du circuit DH dans les tissus d’animaux naïfs, de modèles animaux de douleur chronique et de souris ayant une fonction nociceptive génétiquement modifiée. En outre, les enregistrements MEA dans les tranches de moelle épinière stimulées par 4-AP peuvent être utilisés comme outil de dépistage rapide pour évaluer la capacité de nouveaux composés antinociceptifs à perturber l’activité dans la moelle épinière DH.

Introduction

Les rôles de types spécifiques d’interneurones inhibiteurs et excitateurs dans la moelle épinière DH sont découverts à un rythme rapide 1,2,3,4. Ensemble, les interneurones représentent plus de 95% des neurones de la DH et sont impliqués dans le traitement sensoriel, y compris la nociception. De plus, ces circuits interneurones sont importants pour déterminer si les signaux périphériques montent dans l’axe du neuroaxe pour atteindre le cerveau et contribuer à la perception de la douleur ^5,6,7

Protocole

Des études ont été réalisées sur des souris mâles et femelles c57Bl/6 âgées de 3 à 12 mois. Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées conformément au comité de soins et d’éthique des animaux de l’Université de Newcastle (protocoles A-2013-312 et A-2020-002).

1. Électrophysiologie in vitro

1. Préparation de solutions pour la préparation et l’enregistrement de tranches de moelle épinière
   1. Liquide céphalo-rachidien artificiel
      REMARQUE: Le liquide céphalo-rachidien artificiel (CSPa) est utilisé dans une chambre d’incubation d’interface, où les tranches sont stockées jusqu’au début de l’enregistrement et p....

Résultats

Modèle d’activité du réseau dans la corne dorsale de la moelle épinière
L’application de 4-AP induit de manière fiable une activité rythmique synchrone dans la moelle épinière DH. Cette activité se traduit par une augmentation des PAE et des PFL. Le dernier signal est une forme d’onde à basse fréquence, qui a déjà été décrite dans les enregistrements MEA³⁰. Les changements dans l’activité du PAE et/ou de la LFP après l’application du médicament ref.......

Discussion

Malgré l’importance de la DH spinale dans la signalisation nociceptive, le traitement et les réponses comportementales et émotionnelles qui en résultent qui caractérisent la douleur, les circuits de cette région restent mal compris. L’un des principaux défis dans l’étude de cette question a été la diversité des populations de neurones qui composent ces circuits ^6,31,32. Les progrès récents des tech.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-aminopyridine	Sigma-Aldrich	275875-5G
100% ethanol	Thermo Fisher	AJA214-2.5LPL
CaCl2 1M	Banksia Scientific	0430/1L
Carbonox (Carbogen - 95% O2, 5% CO2)	Coregas	219122
Curved long handle spring scissors	Fine Science Tools	15015-11
Custom made air interface incubation chamber
Foetal bovine serum	Thermo Fisher	10091130
Forceps Dumont #5	Fine Science Tools	11251-30
Glucose	Thermo Fisher	AJA783-500G
Horse serum	Thermo Fisher	16050130
Inverted microscope	Zeiss	Axiovert10
KCl	Thermo Fisher	AJA383-500G
Ketamine	Ceva	KETALAB04
Large surgical scissors	Fine Science Tools	14007-14
Loctite 454 Instant Adhesive	Bolts and Industrial Supplies	L4543G
MATLAB	MathWorks		R2018b
MEAs, 3-Dimensional	Multichannel Systems	60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti	60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in an 8x8 square grid. Electrodes are 12 µm in diameter, 40 µm (100/12/40) or 50 µm (200/12/50) high and equidistantly spaced 100 µm (100/12/40) or 200 µm (200/12/50) apart.
MEA headstage	Multichannel Systems	MEA2100-HS60
MEA interface board	Multichannel Systems	MCS-IFB 3.0 Multiboot
MEA net	Multichannel Systems	ALA HSG-MEA-5BD
MEA perfusion system	Multichannel Systems	PPS2
MEAs, Planar	Multichannel Systems	60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti	60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in either a 8x8 square grid (200/30) or a 6x10 rectangular grid (500/30). Electrodes are 30 µm in diameter and equidistantly spaced 200 µm (200/30) or 500 µm (500/30) apart.
MgCl2	Thermo Fisher	AJA296-500G
Microscope camera	Motic	Moticam X Wi-Fi
Multi Channel Analyser software	Multichannel Systems		V 2.17.4
Multi Channel Experimenter software	Multichannel Systems		V 2.17.4
NaCl	Thermo Fisher	AJA465-500G
NaHCO3	Thermo Fisher	AJA475-500G
NaH2PO4	Thermo Fisher	ACR207805000
Rongeurs	Fine Science Tools	16021-14
Small spring scissors	Fine Science Tools	91500-09
Small surgical scissors	Fine Science Tools	14060-09
Sucrose	Thermo Fisher	AJA530-500G
Superglue			cyanoacrylate adhesive
Tetrodotoxin	Abcam	AB120055
Vibration isolation table	Newport	VH3048W-OPT
Vibrating microtome	Leica	VT1200 S