Cette méthode permettra d’illustrer les mécanismes moléculaires d’un phénomène biologique aux multiples facettes. Tels que la mécanobiologie, l’électrophysiologie optique et l’imagerie des protéines ADN/ARN à super-résolution à l’aide de techniques d’imagerie automatique des cellules vivantes. Ce protocole permet l’acquisition d’images automatiques, multifonctionnelles, à haut débit, à auto-dérive et à long terme.
Il est compatible avec la plupart des plates-formes microscopiques fluorescentes, telles que NYCOM. Quiconque essaie cette technique pour la première fois devrait comprendre la fonction de chaque étape, au lieu de suivre uniquement le protocole strictement, pour assurer une expérience réussie. Commencez par placer la chambre d’environnement sur l’étage motorisé du microscope inversé.
Réglez le débit de CO2 à 160 millilitres par minute et ajustez la température de la chambre. Ajoutez ensuite 40 millilitres d’eau purifiée dans le bain de la chambre. Sortez la boîte de Petri à fond de verre avec les cellules de l’incubateur et placez-la dans la chambre de l’environnement.
Allumez le contrôleur confocal et le microscope inversé. Basculez le chemin de la lumière vers la droite. Observez les cellules qui se fixent à l’aide de Micro Manager.
Si suffisamment de cellules ont été attachées au gel, transférez la boîte de Petri dans l’incubateur. Sinon, poursuivez l’incubation cellulaire pendant encore 30 minutes pour le B2B et 60 minutes pour le cancer du poumon ou les cellules PC-9. Coupez 2 petits morceaux de ruban adhésif et collez-les sur la chambre autour du trou circulaire.
Appliquez ensuite un peu de colle adhésive sur la zone du ruban que la boîte de Petri couvrira. Sortez la boîte de Petri de l’incubateur. Placez lentement la boîte de Petri dans la chambre et laissez le fond du plat entrer en contact avec la colle.
Appuyez sur le couvercle de la boîte de Petri pendant 1 minute pour permettre à la colle d’entrer en contact complet avec la boîte de Petri et de se solidifier. Poussez doucement la boîte de Petri horizontalement pour vous assurer que la colle s’est solidifiée et que la boîte de Petri ne bouge pas. Fermez ensuite le couvercle de la chambre.
Ouvrez IntelliJ et définissez un paramètre T1 à la ligne 93 du fichier elements_script.java. Assurez-vous que cette valeur est supérieure à la durée d’exécution de la macro et des éléments utilisés pour l’imagerie confocale d’un champ de vision. Cliquez sur le bouton Exécuter pour démarrer le projet AMFIP IntelliJ.
Cliquez sur le bouton en direct et multi-désacquisition sur l’interface principale de Micro Manager, puis basculez le trajet lumineux du microscope inversé vers la droite pour l’imagerie en champ lumineux. Passez à l’objectif 10 fois et ouvrez la lumière LED avec l’intensité réglée à 5%Cliquez sur l’objectif du microscope à chemin de lumière et le bouton de la lampe LED dans le panneau TI2 des éléments. Réglez le joystick XY et le bouton du plan Z pour trouver la position correcte et le plan de mise au point du gel sur la boîte de Pétri.
Utilisez l’objectif 10 fois pour trouver les champs de vision appropriés de plusieurs cellules uniques attachées au gel. Cochez la case XY positions multiples dans la fenêtre d’acquisition multidimensionnelle. Cliquez sur le bouton Modifier la liste des positions et observez la fenêtre de la liste des positions de la scène qui apparaît.
Changez l’objectif à 40 fois, augmentez l’intensité de la lumière LED à 15%Réajustez la scène motorisée XY pour localiser les champs de vision et enregistrez les coordonnées en cliquant sur le bouton de marque dans la fenêtre de liste de position de la scène. Enregistrez 6 à 7 champs de vision souhaités. Cliquez sur le bouton Enregistrer sous dans la fenêtre de la liste des positions de la scène pour enregistrer les coordonnées et entrer T1 comme section d’intervalle de temps de l’acquisition d’imagerie à T1 dans la section de point de temps de la fenêtre d’acquisition multidimensionnelle.
Ouvrez les éléments, modifiez le trajet de la lumière vers la droite pour l’imagerie confocale et éteignez la lumière LED. Cliquez ensuite sur le bouton de déverrouillage et allumez le canal laser FITC pour l’imagerie YAP en cochant la case FITC. Après avoir réglé la vitesse de numérisation à 1 image toutes les 2 secondes, faites tourner le bouton du plan Z pour trouver rapidement la position Z des cellules attachées.
Enregistrez les limites inférieure et supérieure de la pile Z. Cliquez sur macro dans le ruban supérieur, sélectionnez l’éditeur de macros dans le menu déroulant macro et entrez les limites inférieure et supérieure de la pile Z dans un fichier macro. Activez le canal laser DAPI pour l’imagerie des billes en cochant la case DAPI pour trouver et enregistrer la position Z focalisée des perles.
Accédez à l’éditeur de macros et entrez les valeurs enregistrées dans le fichier de macros. Pour définir la tâche de déplacement de la scène motorisée à l’aide d’AMFIP, accédez à Micro Manager, cliquez sur plug-ins automation pour ouvrir l’interface utilisateur graphique d’AMFIP. Cliquez ensuite sur les boutons Ajouter un point ou Supprimer un point pour obtenir le nombre exact de champs de vue sélectionnés.
Entrez les coordonnées enregistrées des champs de vision dans le panneau de coordonnées. Définissez la durée totale de l’expérience dans le champ de texte Durée totale de l’expérience. Cliquez sur le bouton de configuration de temps supplémentaire et définissez l’intervalle de temps T2 pour déplacer la scène motorisée vers chaque champ de vision.
Maximisez la taille de la fenêtre des éléments et faites glisser l’interface graphique d’AMFIP sur le côté droit de l’écran pour éviter que l’interface graphique ne perturbe les opérations automatiques du curseur, puis cliquez sur le bouton Entrée. Une fois la première macro terminée. cliquez sur le bouton Acquérir dans la fenêtre d’acquisition multidimensionnelle.
Après avoir terminé l’imagerie à long terme, arrêtez la tâche AMFIP en cliquant sur le bouton de pause dans la fenêtre du plug-in d’automatisation et sur le bouton d’arrêt dans la fenêtre d’acquisition multidimensionnelle. Ouvrez les éléments et définissez l’imagerie de la pile Z en cliquant sur les boutons supérieur et inférieur dans la fenêtre d’acquisition ND. Basculez le chemin de la lumière vers la droite et ouvrez la lumière LED.
Retirez lentement et soigneusement les couvercles de la chambre et de la boîte de Petri tout en surveillant la vue du champ lumineux pour toute dérive du champ de vision. Utilisez une pipette en plastique pour absorber 0,5 millilitre de solution SDS. Tenez soigneusement la pipette en plastique un peu au-dessus du milieu de culture dans la boîte de Pétri et ajoutez 1 à 2 gouttelettes de la solution SDS dans le milieu de culture.
Une fois les cellules et la vue de champ lumineux dissoutes, fermez la lumière LED, basculez le chemin de la lumière vers la gauche, cliquez sur le bouton de verrouillage. Exécutez l’imagerie de la pile Z et enregistrez la pile d’images sous reference_N, où N est le numéro de séquence de chaque champ de vision. Cliquez sur le bouton XY à positions multiples dans la fenêtre d’acquisition multidimensionnelle.
Sélectionnez ensuite le champ de vision suivant et cliquez sur le bouton de référence pour déplacer la scène motorisée vers le deuxième champ de vision. Répétez cette étape pour chaque champ de vision. La localisation nucléaire est celle d’une protéine associée au oui ou YAP dans les ells B2B augmentée avec l’augmentation de la rigidité du substrat, tandis que les cellules PC-9 ont montré une concentration YAP similaire dans le noyau et le cytoplasme sur des substrats de rigidité variable.
La cellule B2B a augmenté de manière monotone la zone de propagation au fil du temps, ainsi qu’une diminution du rapport nucléaire YAP / cytoplasmique, tandis que la cellule PC-9 a maintenu une zone de propagation cellulaire relativement immuable, une orientation et un rapport nucléaire YAP / cytoplasmique tout au long du processus de propagation de 10 heures. Pendant la durée de 10 heures de l’étalement précoce, la cellule B2B représentative a déformé de manière constitutive la surface du substrat et a appliqué une traction cellulaire évolutive dans le temps sur toute la zone cellulaire. En revanche, la cellule PC-9 représentative n’a développé que le déplacement et la traction aux 2 extrémités du corps cellulaire, et sa traction a diminué après 7,5 heures.
Le rapport nucléaire YAP/cytoplasmique et la traction dipolaire des cellules B2B semblaient suivre deux tendances distinctes, suggérant qu’il pourrait y avoir eu deux groupes de cellules B2B qui ont coexisté dans l’expérience. Dans le premier groupe, le rapport nucléaire YAP/cytoplasmique et la traction dipolaire ont augmenté avec l’élargissement de la zone de propagation cellulaire et ont atteint leurs maxima à environ 1 000 micromètres carrés. Dans le deuxième groupe, le rapport nucléaire YAP/cytoplasmique et la traction dipolaire ont augmenté à un rythme plus lent avec l’élargissement de la zone de propagation cellulaire et ont maintenu des valeurs presque constantes lorsque la zone de propagation cellulaire a continué d’augmenter.
Les gammes de piles Z pour tous les canaux laser doivent être déterminées avec soin pour surmonter la dérive potentielle du champ de vision pendant le mouvement de la scène en imagerie à long terme. Cette nouvelle technique permet une imagerie automatique, non invasive à long terme et multiposition, et peut aider à élucider le mécanisme de biologie moléculaire qui nécessite un suivi temporel et spatial des cellules et des organites.
