טכניקות משלימות אלה להעריך ולמדוד את חדירה של כלי דם הגידול באמצעות משקל מולקולרי גבוה Dextran. פרוטוקול הרקמה הקבועה מציע כיסוי גידול גדול יותר, הוא תפוקה גבוהה, ואינו דורש ציוד הדמיה מולטיפוטונים. מצד שני, פרוטוקול ההדמיה הבין-ויטמינים מציע מידע בזמן אמת על הקינטיקה, הפונקציה והגומלין הדינמי של התאים במיקרו-וירוס הגידולי של גרורות או TMEM.
אז הפרוטוקולים המוצגים כאן מאפשרים מדידה ישירה של חמת כלי דם תלויי TMEM אשר מאוד בקורלציה עם הפצת תאים סרטניים, ולכן פרוטוקולים אלה יכולים לשמש כדי להעריך את הפוטנציאל גרורתי של הגידולים. כדי ליצור חתיכות של רקמת הגידול מתאים להשתלה, להתחיל עם המתת חסד של עכברים נושאי גידול כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מניחים צלחת פטרי עם DMEM / F12 תא תרבות בינוני על קרח במכסה המנוע אדים.
הביאו את העכבר למכסה המנוע של האדים וחטאו את בטן העכבר באלכוהול אתיל של 70%. בעזרת כפפות סטריליות וכלים כירורגיים, מוציאים את הגידולים ומ מניחים אותם בצלחת פטרי. חותכים את הגידול לחתיכות קטנות, להשליך את כל מנות נמק בזמן שהם בצלחת פטרי.
כדי להשתיל את חלקי הגידול למארחים הנמענים, הרדימו עכברים שגדלו עם מקרופאגים מהונדסים גנטית, המסומנים באופן פלואורסצנטי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. להפחית את ההרדמה כ 3%isofluorane ולהחיל משחה עיניים על העיניים של העכבר כדי למנוע ייבוש. הסר שיער מעל בלוטת החלב הרביעית של העכבר.
לאחר ניקוי העור עם חיטוי, להשתמש במכשירים מעוקרים כדי להפוך חתך קטן בערך שניים עד שלושה מילימטרים רק נחות הפטמה הרביעית. לנתח עד כרית שומן חלבי נחשף. קח חתיכת גידול מהצלחת פטרי ומעיל במטריצה חוץ תאית מלאכותית.
גידולים בהשתלה מתחת ל כרית השומן הרביעית. סגור את החתך באמצעות דבק ציאנואקרילאט. לבסוף, להוסיף מיליליטר אחד של אנטיביוטיות enrofloxacin למי השתייה של בעלי החיים.
הרדמה של העכבר והכנסת קטטר וריד זנב כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הפוך חתך קו האמצע האורך החל מיד מעולה על איברי המין לשאת את החתך עד לרמה של ההיבט העליון של בלוטת החלב הרביעית. לשאת את החתך רוחבי להיבט מעולה של בלוטת החלב הרביעית.
זה קריטי כדי למנוע פגיעה באספקת הדם בשלב זה. לייצב את דש העור על ידי הדבקת חתיכה קטנה של גומי נוקשה מדידה שני על שני סנטימטרים לצד העור של הדש. הגידולים צריכים להיות במרכז האזור להיות מיוצב על ידי הגומי.
החל סרט קטן של cyanoacrylate על השפה החיצונית של מסגרת חלון הדמיה בהתאמה אישית. עכשיו להחיל טיפה קטנה של PBS למרכז זכוכית הכיסוי. הימנע ממגע בין cyanoacrylate על מסגרת החלון PBS על הזכוכית, כדי למנוע פילמיזציה מוקדמת של cyanoacrylate.
יבש את רקמת הדש שמסביב עם ניגוב מעבדה. מדביקים את חלון ההדמיה הקטן לדש הרקמה עם הגידול במרכז הצמצם הצלול. מעבירים את קטטר העכבר ווריד הזנב הרדמה לשלב המיקרוסקופ.
נקוט זהירות רבה כדי להבטיח קטטר וריד הזנב לא לנשור. בשלב זה, לבצע הדמיה תוך ואטרונית ארוכת יותר כמתואר בפרוטוקול הטקסט ובפרסום הקודם שלנו JoVE. לניתוח תפוקה גבוה יותר וכיסוי גידולים גדול יותר, השתמשו בכשל חיסוני ברקמה קבועה כדי להעריך את חמת כלי הדם בניווך TMEM.
כדי לבצע כתמי immunofluorescence, תחילה להכין את הדגימות כמתואר בפרוטוקול הטקסט, ולאחר מכן לבצע אחזור אנטיגן על ידי חימום החלקים שקועים ציטראט קרוב לנקודת הרתיחה במשך 20 דקות. לאחר מתן הדגימות להתקרר לטמפרטורת החדר במשך 15 עד 20 דקות, לשטוף את הדגימות PBS שלוש פעמים במשך שתי דקות כל לשטוף. לחסום במשך 60 עד 90 דקות בחוצץ חסימה, ולאחר מכן דגירה דגימות עם תערובת של חולדה ראשונית נוגדנים מהירים אשר היעד אנדומקין ו tetramethylrhodamine בהתאמה.
לאחר הדגירה, לשטוף את הדגימות שלוש פעמים PBST במשך שתי דקות כל אחד. דגימות דגירה עם תערובת של נוגדני חמור משני נגד IgG עכברוש ו IgG מהירה, ולאחר מכן לשטוף את הדגימות שלוש פעמים PBST במשך שתי דקות כל אחד. בצע הכתמת DAPI שגרתית והתקע את השקופיות באמצעות מדיום הרכבה קשיח ללא גליצרול.
אחסן את הדגימות במקום חשוך עד לסריקה. לקבלת תוצאות מיטביות, סרוק את השקופיות בסורק דיגיטלי שלם של שקופיות. כדי לבצע ניתוח תמונה, לכוד 10 שדות בה הספק גבוה בכל מקרה באמצעות כל תוכנה המתאימה לפתולוגיה דיגיטלית.
שמור את ערוצי אנדומווצין ו- TMR בנפרד כמו TIFF. באמצעות ImageJ, להעלות את קבצי TIFF ולהמיר אותם לתמונות 8 סיביות. סם את תמונות 8 הסיביות לרמת הפקד השלילי והפיק שתי תמונות בינאריות המציגות את מסיכות האנדומוקין וה- TMR.
מתוך הכלים הבינאריים, בחר מלא חורים על מסיכת האנדומוקין. צור את התמונה Dextran סף ולשמור אותו כמו Dextran ROI. כמו כן, ליצור את התמונה אנדומוצין סף ולשמור אותו כמו ROI כלי דם וליצור את התמונה אנדומוצין הפוך ולשמור אותו כמו ROI בזבזני.
הבא ליצור את ROI בזבזני מצטלבים ותדמית Dextran ROI ולשמור אותו כמו ROI Dextran בזבזני. לבסוף לשמור את התמונה כולה כמו גידול ROI. חלק את אזור Dextran ROI בזבזני על ידי אזור ROI הגידול לרבים על ידי 100 כדי ליצור את האזור אחוז כי Dextran בזבזני מכסה את הגידול כולו.
חזור על התהליך עבור 10 עד 20 שדות בה הספק גבוה לכל מקרה וליצור Dextran בזבזני ממוצע עבור כל מקרה. מוצגת כאן תמונה של בלוטת החלב בריאה ומתפתחת בתוך חיה מהומרת. כלי הדם מסומנים על ידי TMR Dextran באפיתל אדום, מחך רקיע מסומן על ידי חלבון פלואורסצנטי dendra2 בירוק, מקרופאגים מסומנים על ידי חלבון פלואורסצנטי ציאן.
לעומת זאת, קרצינומה פולשנית מושתלת עם תווית דנדרה2 מוצגת בבעל חיים עם מקרופאגים וכלי שיט מסומנים. רקמת ריאה בריאה הודמיה דרך חלון הדמיית ריאות בתוך עכבר עם כלי דם מסומנים. גרורות ריאות ניכרות בעקבות הזרקה של תאים סרטניים לתוך חיה מהודקת עם מקרופאגים מסומנים וסקולטורה.
מוצגים כאן תמונות סטילס מסרט הדמיה תוך-גולגולתי שפג הזמן של כלי ניאו-אנגיוגניים בעלי משקל מולקולרי גבוה, המסומן על-ידי Dextran, בתוך קרצינומה פולשנית מושתלת של השד. הקו הצהוב המקווקו מציין את קווי המתאר של אזור דליפת כלי הדם הזורמים לפני, במהלך ואחרי אירוע הדליפה. פתח TMEM נלכד בהדמיה חיה.
immunofluorescence רב ערוצי מראה אנדומוצין, משקל מולקולרי גבוה Dextran, התמונה הממוזגת שלהם יחד עם DAPI, כמו גם את כלי הדם סף המתאים מסכות דקסטרן בזבזני. החלק הרציף המתאים של אימונוהיסטוכימיה TMEM מוצג גם. פרופיל כלי הדם הרחק TMEM מופיע כפרופיל כלי דם שאינו דולף, ואילו פרופיל כלי הדם הקשורים TMEM מופיע כפרופיל כלי דם דולף.
חשוב מאוד להימנע מחיתוך כלי הדם המספקים את הגידול במהלך החשיפה הכירורגית של הגידול. המתודולוגיה המתוארת כאן יכולה להיות משולבת עם טיפול תרופתי, אותו דבר כי עיכוב תפקוד TMEM, מניעת חבירה כלי דם, או אפילו נרמול כלי דם הגידול כדי למדוד את השפעתם ויעילותם. עם פרוטוקולים אלה הוכחנו בעבר כי כימותרפיה משפרת את חבירה כלי הדם והפצת תאים סרטניים ולמעשה כי שינויים פרו גרורתיים אלה ניתן לעקוף על ידי ניהול שותף של מעכבי תפקוד TMEM.
