Estas técnicas complementarias evalúan y miden la permeabilidad de la vasculatura tumoral utilizando Dextran de alto peso molecular. El protocolo de tejido fijo ofrece una mayor cobertura tumoral, es de alto rendimiento y no requiere equipos de imágenes multifotográfica. Por otro lado, el protocolo de imágenes intravital ofrece información en tiempo real sobre la cinética, la función y la interacción dinámica de las células en el microambiente tumoral de metástasis o TMEM.
Así que los protocolos presentados aquí permiten la medición directa de la permeabilidad vascular dependiente de TMEM que se correlaciona fuertemente con la diseminación de células cancerosas, por lo tanto, estos protocolos se pueden utilizar para evaluar el potencial metastásico de los tumores. Para generar trozos de tejido tumoral adecuados para el trasplante, comience con la eutanasia de ratones portadores de tumores como se describe en el protocolo de texto. Coloque un plato de Petri con medio de cultivo celular DMEM/F12 sobre hielo en la campana de humo.
Lleve el ratón a la campana de humo y desinfecte el abdomen del ratón con 70% de alcohol etílico. Usando guantes estériles y herramientas quirúrgicas, retire los tumores y colóquelos en el plato Petri. Corta el tumor en trozos pequeños, descartando las porciones necróticas mientras están en el plato Petri.
Para trasplantar las piezas tumorales en huéspedes receptores, anestesia a los ratones que han sido criados con macrófagos modificados genéticamente y con etiqueta fluorescente, tal como se describe en el protocolo de texto. Reduzca la anestesia a aproximadamente 3%isofluorano y aplique pomada oftálmica a los ojos del ratón para evitar el secado. Retire el vello de la cuarta glándula mamaria del ratón.
Después de limpiar la piel con antiséptico, utilice instrumentos esterilizados para hacer una pequeña incisión aproximadamente de dos a tres milímetros sólo inferior al cuarto pezón. Disecciona hasta que la almohadilla de grasa mamaria esté expuesta. Tome una pieza tumoral de la placa De Petri y cubra la matriz extracelular artificial.
Tumores de trasplante debajo de la cuarta almohadilla de grasa mamaria. Cierre la incisión con adhesivo de cianoacrilato. Por último, añadir un mililitro de antibiótico enrofloxacino al agua potable de los animales.
Anestesar el ratón e insertar un catéter de vena de cola como se describe en el protocolo de texto. Hacer una incisión longitudinal de línea media comenzando inmediatamente superior a los genitales y llevar la incisión hasta el nivel del aspecto superior de la cuarta glándula mamaria. Lleve la incisión transversal al aspecto superior de la cuarta glándula mamaria.
Es fundamental evitar comprometer el suministro de sangre en este punto. Estabilice la solapa de la piel colocando un pequeño trozo de goma rígida que mide de dos por dos centímetros al lado de la piel de la solapa. Los tumores deben estar en el centro de la zona que está siendo estabilizada por el caucho.
Aplique una pequeña película de cianoacrilato en el borde exterior del marco de la ventana de imágenes a medida. Ahora aplique una pequeña gota de PBS en el centro del vidrio de la cubierta. Evite el contacto entre el cianoacrilato en el marco de la ventana y el PBS en el vidrio para evitar la polimerización prematura del cianoacrilato.
Seque el tejido de la solapa circundante con una toallita de laboratorio. Fije la pequeña ventana de imágenes a la solapa de tejido con el tumor en el centro de la abertura transparente. Transfiera el ratón anestesiado y el catéter de vena de cola a la etapa del microscopio.
Tenga mucho cuidado para asegurarse de que el catéter de la vena de cola no se caiga. En este punto, realice imágenes intravitales a largo plazo como se describe en el protocolo de texto y en nuestra publicación anterior de JoVE. Para un análisis de mayor rendimiento y una mayor cobertura tumoral, utilice la inmunofluorescencia en el tejido fijo para evaluar la permeabilidad vascular mediada por TMEM.
Para realizar la tinción de inmunofluorescencia, primero prepare las muestras como se describe en el protocolo de texto, luego realice la recuperación de antígenos calentando las secciones sumergidas en citrato cerca del punto de ebullición durante 20 minutos. Después de dejar que las muestras se enfríen a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos, lave las muestras en PBS tres veces durante dos minutos cada lavado. Bloquear durante 60 a 90 minutos en tampón de bloqueo, luego incubar muestras con una mezcla de rata primaria y anticuerpos rápidos que se dirigen a la endomucin y la tetrametilrhodamina respectivamente.
Después de la incubación, lave las muestras tres veces en PBST durante dos minutos cada una. Incubar muestras con una mezcla de anticuerpos de burro secundarios contra La Rata IgG y IgG rápido, luego lavar las muestras tres veces en PBST durante dos minutos cada una. Realice una tinción DAPI de rutina y monte las diapositivas utilizando un medio de montaje duro sin glicerol.
Guarde las muestras en un lugar oscuro hasta escanear. Para obtener resultados óptimos, escanee las diapositivas en un escáner digital de diapositivas completa. Para realizar análisis de imágenes, capture 10 campos de alta potencia por caso utilizando cualquier software adecuado para la patología digital.
Guarde los canales endomucin y TMR por separado como TIFF. Con ImageJ, cargue los archivos TIFF y conviértalos en imágenes de 8 bits. Umbral las imágenes de 8 bits al nivel del control negativo y generar dos imágenes binarizadas que muestran las máscaras endomucin y TMR.
En las herramientas Binarias, seleccione Rellenar taladros en la máscara de endomucin. Genere la imagen de Dextran con umbral y guárdela como ROI de Dextran. Además, genere la imagen de endomucin umbral y guárdela como ROI vascular y genere la imagen endomucin invertida y guárdela como ROI extravascular.
A continuación, genere la imagen de ROI Extravascular intersectado y ROI Dextran y guárdela como ROI Extravascular Dextran. Finalmente guarde toda la imagen como Tumor ROI. Divida el área de ROI Extravascular Dextran por el área de ROI tumoral y multiplique por 100 para generar el área porcentual que cubre el Dextran Extravascular en todo el tumor.
Repita el proceso para 10 a 20 campos de alta potencia por caso y genere un Dextran Extravascular promedio para cada caso. Aquí se muestra una imagen de una glándula mamaria sana y en desarrollo dentro de un animal transgénico. La vasculatura está etiquetada por TMR Dextran en rojo, epitelio dúctil mamario está etiquetado por la proteína fluorescente dendra2 en verde, y los macrófagos están etiquetados por una proteína fluorescente cian.
Por el contrario, se muestra un carcinoma dúctil invasivo con etiqueta dendra2 trasplantado en un animal con macrófagos y vasos etiquetados. El tejido pulmonar sano se visualizó a través de una ventana de imágenes pulmonares dentro de un ratón con vasculatura etiquetada. Las metástasis pulmonares son evidentes después de la inyección de células tumorales en un animal transgénico con macrófagos etiquetados y vasculatura.
Aquí se muestran imágenes fijas de una película de imágenes intravitales de alto nivel molecular de vasos neo-angiogénicos con etiqueta Dextran de alto peso molecular dentro de un carcinoma invasivo de la mama con etiqueta de dendra2 trasplantado. La línea amarilla punteada denota el contorno del área de fuga vascular transitoria antes, durante y después del evento de fuga. Una puerta TMEM se captura en imágenes en vivo.
La inmunofluorescencia multicanal muestra endomucin, de alto peso molecular Dextran, su imagen combinada junto con DAPI, así como los vasos sanguíneos umbralados correspondientes y máscaras Dextran extravasculares. También se muestra la sección secuencial correspondiente de la inmunohistoquímica TMEM. El perfil vascular alejado de TMEM aparece como un perfil vascular no fugado, mientras que el perfil vascular asociado a TMEM aparece como un perfil vascular con fugas.
Es muy importante evitar cortar los vasos sanguíneos que suministran el tumor durante la exposición quirúrgica del tumor. La metodología descrita aquí se puede combinar con el tratamiento farmacológico, lo mismo que inhibe la función TMEM, la prevención de la permeabilidad vascular, o incluso la normalización de la vasculatura tumoral para medir su impacto y eficacia. Con estos protocolos hemos demostrado previamente que la quimioterapia mejora la permeabilidad vascular y la diseminación de células cancerosas y, de hecho, que estos cambios pro-metastásicos pueden ser eludidos por la administración conjunta de inhibidores de la función TMEM.
