Essas técnicas complementares avaliam e medem a permeabilidade da vasculatura tumoral utilizando dextran de alto peso molecular. O protocolo de tecido fixo oferece maior cobertura tumoral, é de alto rendimento e não requer equipamento de imagem multifotono. Por outro lado, o protocolo de imagem intravital oferece informações em tempo real sobre a cinética, função e interação dinâmica das células no microambiente tumoral de metástase ou TMEM.
Assim, os protocolos aqui apresentados permitem a medição direta da permeabilidade vascular dependente do TMEM que se correlaciona fortemente com a disseminação de células cancerosas, portanto esses protocolos podem ser utilizados para avaliar o potencial metastático dos tumores. Para gerar pedaços de tecido tumoral adequados para transplante, comece com eutanásia de camundongos portadores de tumores, conforme descrito no protocolo de texto. Coloque uma placa de Petri com meio de cultura celular DMEM/F12 no gelo no capô da fumaça.
Leve o rato para o capô da fumaça e higienize o abdômen do rato com 70% de álcool etílico. Usando luvas estéreis e ferramentas cirúrgicas, remova os tumores e coloque-os na placa de Petri. Corte o tumor em pequenos pedaços, descartando porções necrosadas enquanto estiverem na placa de Petri.
Para transplantar os pedaços do tumor em hospedeiros receptores, anestesizem camundongos que foram criados com macrófagos geneticamente modificados e rotulados fluorescentemente, conforme descrito no protocolo de texto. Reduza a anestesia para aproximadamente 3% de isofluorano e aplique pomada oftálmica aos olhos do camundongo para evitar a secagem. Remova o cabelo da quarta glândula mamária do rato.
Depois de limpar a pele com antisséptico, use instrumentos esterilizados para fazer uma pequena incisão de aproximadamente dois a três milímetros apenas inferior ao quarto mamilo. Disseca até que a almofada de gordura mamária seja exposta. Pegue uma peça de tumor da placa de Petri e cubra em matriz extracelular artificial.
Transplante de tumores sob a quarta almofada de gordura mamária. Feche a incisão usando adesivo de cianoacrilato. Por fim, adicione um mililitro de antibiótico enrofloxacina à água potável dos animais.
Anestesiar o mouse e inserir um cateter da veia da cauda conforme descrito no protocolo de texto. Faça uma incisão longitudinal de linha média começando imediatamente superior aos genitais e leve a incisão até o nível do aspecto superior da quarta glândula mamária. Leve a incisão transversal ao aspecto superior da quarta glândula mamária.
É fundamental evitar comprometer o suprimento de sangue neste momento. Estabilize a aba da pele afixando um pequeno pedaço de borracha rígida medindo dois por dois centímetros ao lado da pele da aba. Os tumores devem estar no centro da área sendo estabilizados pela borracha.
Aplique uma pequena película de cianoacrilato na borda externa da moldura da janela de imagem feita sob medida. Agora aplique uma pequena gota de PBS no centro do vidro de cobertura. Evite o contato entre o cianoacrilato na moldura da janela e o PBS no vidro para evitar a polimerização prematura do cianoacrilato.
Seque o tecido de retalho ao redor com um lenço de laboratório. Afixe a pequena janela de imagem na aba de tecido com o tumor no centro da abertura clara. Transfira o cateter anestoizado do rato e da veia da cauda para o estágio do microscópio.
Tenha extrema cautela para garantir que o cateter da veia da cauda não caia. Neste ponto, realize imagens intravitais de longo prazo, conforme descrito no protocolo de texto e em nossa publicação anterior do JoVE. Para maior análise de rendimento e maior cobertura tumoral, use imunofluorescência em tecido fixo para avaliar a permeabilidade vascular mediada pelo TMEM.
Para realizar a coloração da imunofluorescência, primeiro prepare as amostras como descrito no protocolo de texto e, em seguida, realize a recuperação de antígenos aquecendo as seções submersas em citrato perto do ponto de ebulição por 20 minutos. Depois de deixar as amostras esfriarem até a temperatura ambiente por 15 a 20 minutos, lave as amostras em PBS três vezes por dois minutos cada lavagem. Bloqueie por 60 a 90 minutos no tampão de bloqueio, em seguida, incubar amostras com uma mistura de ratos primários e anticorpos rápidos que visam a endomucina e a tetrametodamina, respectivamente.
Após a incubação, lave as amostras três vezes em PBST por dois minutos cada. Incubar amostras com uma mistura de anticorpos de burro secundário contra Rat IgG e IgG rápido, em seguida, lave as amostras três vezes em PBST por dois minutos cada. Realize uma coloração da DAPI de rotina e monte os slides usando um meio de montagem dura sem glicerol.
Armazene as amostras em um local escuro até a varredura. Para obter resultados ideais, escaneie os slides em um scanner de slides digital. Para realizar a análise de imagens, capture 10 campos de alta potência por caso usando qualquer software adequado para patologia digital.
Salve os canais de endomucina e TMR separadamente como TIFF. Usando ImageJ, carregue os arquivos TIFF e converta-os em imagens de 8 bits. Limite as imagens de 8 bits ao nível do controle negativo e gere duas imagens binarizadas mostrando as máscaras de endomucina e TMR.
A partir das ferramentas binárias, selecione Preencher furos na máscara de endomucina. Gere a imagem limiar do Dextran e salve-a como ROI do Dextran. Além disso, gere a imagem de endomucina limiar e salve-a como ROI Vascular e gere a imagem de endomucina invertida e salve-a como ROI extravascular.
Em seguida, gere a imagem do ROI Extravascular e do ROI DoXtran e salve-a como ROI Extravascular Dextran. Finalmente salve toda a imagem como ROI tumoral. Divida a área extravascular do ROI do Dextran pela área do ROI tumoral e multiplique por 100 para gerar a área percentual que o Dextran Extravascular cobre em todo o tumor.
Repita o processo para 10 a 20 campos de alta potência por caixa e gere um Dextran extravascular médio para cada caso. Mostrada aqui é uma imagem de uma glândula mamária saudável e em desenvolvimento dentro de um animal transgênico. A vasculatura é rotulada por TMR Dextran em vermelho, epitélio dúctil mamário é rotulado pela proteína fluorescente dendra2 em verde, e macrófagos são rotulados por uma proteína fluorescente ciano.
Em contraste, um carcinoma dútil invasivo com rótulo de dendra2 é mostrado em um animal com macrófagos e vasos rotulados. Tecido pulmonar saudável foi visualizado através de uma janela de imagem pulmonar dentro de um rato com vasculatura rotulada. Metástases pulmonares são evidentes após a injeção de células tumorais em um animal transgênico com macrófagos rotulados e vasculatura.
Aqui estão imagens intravitais de um filme de imagem intravital de alto peso molecular rotulado de Vasos neo-angiogênicos dentro de um carcinoma invasivo de dendra2 transplantado da mama. A linha amarela pontilhada denota o contorno da área de vazamento vascular transitório antes, durante e depois do evento de vazamento. Uma porta TMEM é capturada em imagens ao vivo.
A imunofluorescência multicanal mostra endomucina, de alto peso molecular Dextran, sua imagem mesclada junto com o DAPI, bem como o vaso sanguíneo limiar correspondente e máscaras Extravasculares Dextran. A seção sequencial correspondente da imunohistoquímica TMEM também é mostrada. O perfil vascular afastado do TMEM aparece como um perfil vascular não vazado, enquanto o perfil vascular associado ao TMEM aparece como um perfil vascular vazado.
É muito importante evitar o corte dos vasos sanguíneos que fornecem o tumor durante a exposição cirúrgica do tumor. A metodologia aqui descrita pode ser combinada com o tratamento medicamentoso, o mesmo que inibir a função TMEM, prevenir a permeabilidade vascular, ou até mesmo normalizar a vasculatura tumoral para medir seu impacto e eficácia. Com estes protocolos, demonstramos anteriormente que a quimioterapia aumenta a permeabilidade vascular e a disseminação de células cancerosas e, na verdade, que essas alterações pró-metastáticas podem ser contornadas pela coadministração de inibidores da função TMEM.
