これらの相補的な技術は、高分子量デキストランを用いて腫瘍血管系の透過性を評価および測定する。固定組織プロトコルはより大きい腫瘍の適用範囲を提供し、高い効率、そして多光子のイメージ投射装置を要求しない。一方、生体内イメージングプロトコルは、転移またはTMEMの腫瘍微小環境における細胞の動態、機能、および動的相互作用に関するリアルタイム情報を提供する。
そこで、ここで提示されるプロトコルは、がん細胞の普及と強く相関するTMEM依存性血管透過性の直接測定を可能にし、したがってこれらのプロトコルは腫瘍の転移電位を評価するために使用することができる。移植に適した腫瘍組織の断片を生成するには、テキストプロトコルに記載されているように腫瘍を持つマウスの安楽死から始める。DMEM/F12細胞培養培地を入れたペトリ皿をフュームフードの氷の上に置きます。
マウスをヒュームフードに持ち込み、70%エチルアルコールでマウスの腹部を消毒します。滅菌手袋と外科用ツールを使用して、腫瘍を取り除き、ペトリ皿に入れます。ペトリ皿の中にいる間、壊死部分を捨てて、腫瘍を小さく切り取ります。
腫瘍片をレシピエント宿主に移植するために、テキストプロトコルに記載されているように、遺伝子操作された、蛍光標識されたマクロファージで育てられたマウスを麻酔する。麻酔を約3%イソフルオランに減らし、マウスの目に眼科軟膏を塗布して乾燥を防ぎます。マウスの4番目の乳腺の上から髪を取り除きます。
防腐剤で肌を洗浄した後、滅菌器具を使用して、4番目の乳首よりわずか2〜3ミリメートルの小さな切開を行います。乳腺脂肪パッドが露出するまで解剖します。ペトリ皿から腫瘍片を取り、人工細胞外マトリックスでコーティングします。
第4乳腺脂肪パッドの下に移植腫瘍.シアノアクリル酸接着剤を使用して切開を閉じます。最後に、動物の飲料水にエンロフロキサシン抗生物質を1ミリリットル加えます。
マウスを麻酔し、テキストプロトコルに記載されているように尾静脈カテーテルを挿入します。性器よりも直ちに優れた長手方向の正中線切開を行い、4番目の乳腺の優れた側面のレベルまで切開を運びます。切開横断を第4乳腺の優れた側面に持ち歩く。
この時点で血液供給を損なうことを避けることは重要です。2×2センチメートルの硬質ゴムをフラップの皮膚側に貼り付け、皮膚フラップを安定させます。腫瘍は、ゴムによって安定化される領域の中心にあるべきです。
カスタムメイドのイメージングウィンドウフレームの外縁にシアノアクリルの小さなフィルムを適用します。今度はカバーガラスの中央にPBSの小さな液滴を適用します。シアノアクリル酸の早期重合を避けるために、窓枠のシアノクリレートとガラス上のPBSとの間の接触を避けてください。
周囲のフラップ組織を実験室で拭いて乾かします。小さな画像化窓を透明開口の中心に腫瘍を有する組織フラップに貼付する。麻酔をしたマウスと尾静脈カテーテルを顕微鏡ステージに移します。
尾静脈カテーテルが脱落しないように細心の注意を払ってください。この時点で、テキストプロトコルおよび以前のJoVE出版物に記載されているように、長期的なインビタルイメージングを行います。より高いスループット分析およびより大きな腫瘍被覆のために、固定組織の免疫蛍光を使用して、TMEM媒介血管透過性を評価する。
免疫蛍光染色を行うために、まずテキストプロトコルに記載されているようにサンプルを調製し、次に沸点に近いクエン酸に沈んだ部分を20分間加熱して抗原検索を行う。試料を室温まで15~20分間冷ました後、各洗浄を2分間PBSで3回洗浄します。ブロックは、ブロッキングバッファーで60〜90分間、エンドゥシンとテトラメチルロダミンをそれぞれ標的とする一次ラットと迅速な抗体の混合物でサンプルをインキュベートします。
インキュベーションに続き、サンプルをPBSTでそれぞれ2分間3回洗浄します。ラットIgGと急速IgGに対する二次ロバ抗体の混合物でサンプルをインキュベートし、次いでサンプルをPBSTでそれぞれ2分間洗浄します。グリセロールフリーのハードマウント媒体を用いて、定期的なDAPI染色を行い、スライドを取り付けます。
スキャンするまで暗い場所にサンプルを保管してください。最適な結果を得るには、デジタル全体スライド スキャナでスライドをスキャンします。画像解析を行うために、デジタル病理学に適したソフトウェアを使用して、ケースごとに10の高出力フィールドをキャプチャします。
エンドゥシンとTMRチャンネルをTIFFとして別々に保存します。ImageJ を使用して TIFF ファイルをアップロードし、8 ビット イメージに変換します。8ビット画像を負のコントロールのレベルまでしきい値し、エンオブシンとTMRマスクを示す2つの二項化画像を生成する。
バイナリツールから、エンドゥシンマスクの穴を埋めるを選択します。しきい値 Dextran イメージを生成し、Dextran ROI として保存します。また、閾値エンドロチン画像を生成し、血管ROIとして保存し、逆エンドゥシン画像を生成し、血管外ROIとして保存します。
次に、交差する血管外ROIとデキストランROI画像を生成し、血管外デキストランROIとして保存します。最後に、画像全体を腫瘍ROIとして保存します。腫瘍ROI領域で血管外デキストランROI領域を分割し、100を掛けて、腫瘍全体で血管外デキストランがカバーするパーセント領域を生成する。
1ケースあたり10〜20の高出力フィールドに対してこのプロセスを繰り返し、各ケースに平均血管外デキストランを生成します。ここに示されているのは、トランスジェニック動物内で健康で発達している乳腺の画像です。血管系はTMRデキストランによって赤で標識され、乳腺管内皮は緑色で蛍光タンパク質dendra2によって標識され、マクロファージはシアン蛍光タンパク質によって標識される。
対照的に、移植されたdendra2標識された侵襲性性腺癌は、標識されたマクロファージおよび血管を有する動物に示されている。健康な肺組織は、標識された血管系を有するマウス内の肺イメージングウィンドウを介して視覚化された。肺癌転移は、標識されたマクロファージおよび血管系を有するトランスジェニック動物への腫瘍細胞の注入後に明らかである。
ここに示されているのは、移植されたdendra2標識された乳房の侵襲性癌内の高分子量デキストラン標識ネオ血管形成血管の経時過ぎのインビタルイメージング映画からの静止画である。黄色の点線は、漏れイベントの前後、中、および後の一過性血管漏れ領域の輪郭を示します。TMEMの出入り口はライブのイメージ投射で捕獲される。
多チャネル免疫蛍光は、エンドーミン、高分子量デキストラン、DAPIと共にそれらのマージされた画像、ならびに対応する閾値血管および血管外デキストランマスクを示す。TMEM免疫検査の対応する逐次部も示されている。TMEMから離れた血管プロファイルは非漏出血管プロファイルとして現れるのに対し、TMEM関連血管プロファイルは漏出血管プロファイルとして現れる。
腫瘍の外科的暴露の間に腫瘍を供給する血管を切断することを避けることは非常に重要である。ここで説明する方法論は、薬剤治療と組み合わせることができ、TMEM機能を阻害することと同じ、血管透過性を予防すること、あるいは腫瘍血管系を正常化してそれらの影響および有効性を測定する。このプロトコルを用いて、化学療法は血管透過性および癌細胞の普及を促進し、実際にこれらの転移前の変化はTMEM機能の阻害剤の共投与によって回避できることを実証した。
