Ces techniques complémentaires évaluent et mesurent la perméabilité de la vascularisation tumorale à l’aide du dextran de poids moléculaire élevé. Le protocole de tissu fixe offre une plus grande couverture tumorale, est à haut débit, et ne nécessite pas d’équipement d’imagerie multiphoton. D’autre part, le protocole intravital d’imagerie offre des informations en temps réel sur la cinétique, la fonction et l’interaction dynamique des cellules dans le microenvironnement tumoral de la métastase ou TMEM.
Ainsi, les protocoles présentés ici permettent la mesure directe de la perméabilité vasculaire dépendante du TMEM qui est fortement corrélée avec la dissémination des cellules cancéreuses, c’est pourquoi ces protocoles peuvent être utilisés pour évaluer le potentiel métastatique des tumeurs. Pour générer des morceaux de tissu tumoral adaptés à la transplantation, commencez par l’euthanasie des souris tumorales comme décrit dans le protocole de texte. Placer une boîte de Pétri avec le milieu de culture cellulaire DMEM/F12 sur la glace dans le capot des vapeurs.
Apportez la souris à la hotte de fumée et assainir l’abdomen de la souris avec 70% d’alcool éthylique. À l’aide de gants stériles et d’outils chirurgicaux, retirez les tumeurs et placez-les dans la boîte de Pétri. Couper la tumeur en petits morceaux, en jetant toutes les parties nécrotiques pendant qu’ils sont dans la boîte de Pétri.
Pour transplanter les morceaux de tumeur dans les hôtes destinataires, anesthésier les souris qui ont été soulevées avec des macrophages génétiquement modifiés et étiquetés fluorescents comme décrit dans le protocole de texte. Réduire l’anesthésie à environ 3% d’isofluorane et appliquer de l’onguent ophtalmique sur les yeux de la souris pour éviter le séchage. Retirer les cheveux de plus de la quatrième glande mammaire de la souris.
Après avoir nettoyé la peau avec de l’antiseptique, utilisez des instruments stérilisés pour faire une petite incision d’environ deux à trois millimètres juste inférieure au quatrième mamelon. Disséquer jusqu’à ce que la graisse mammaire soit exposée. Prenez un morceau de tumeur de la boîte de Petri et enduit dans la matrice extracellulaire artificielle.
Tumeurs de greffe sous la quatrième garniture mammaire de graisse. Fermer l’incision à l’aide d’adhésif cyanoacrylate. Enfin, ajoutez un millilitre d’antibiotique enrofloxacine à l’eau potable des animaux.
Anesthésier la souris et insérer un cathéter de veine de queue tel que décrit dans le protocole de texte. Faire une incision longitudinale midline à partir immédiatement supérieure aux organes génitaux et porter l’incision jusqu’au niveau de l’aspect supérieur de la quatrième glande mammaire. Porter l’incision transversale à l’aspect supérieur de la quatrième glande mammaire.
Il est essentiel d’éviter de compromettre l’approvisionnement en sang à ce stade. Stabilisez le rabat cutané en apposant un petit morceau de caoutchouc rigide mesurant deux par deux centimètres sur le côté peau du rabat. Les tumeurs devraient être au centre de la zone stabilisée par le caoutchouc.
Appliquez un petit film de cyanoacrylate sur le bord extérieur du cadre de fenêtre d’imagerie sur mesure. Maintenant, appliquez une petite gouttelette de PBS au centre du verre de couverture. Évitez tout contact entre le cyanoacrylate sur le cadre de la fenêtre et le PBS sur le verre pour éviter la polymérisation prématurée du cyanoacrylate.
Séchez le tissu d’aileron environnant avec un lingette de laboratoire. Apposer la petite fenêtre d’imagerie sur le volet tissulaire avec la tumeur au centre de l’ouverture claire. Transférer le cathéter anesthésié de la souris et de la veine de la queue au stade du microscope.
Faire preuve d’une extrême prudence pour s’assurer que le cathéter de veine de la queue ne tombe pas. À ce stade, effectuer l’imagerie intravitale à long terme tel que décrit dans le protocole texte et dans notre publication précédente JoVE. Pour une analyse plus élevée du débit et une plus grande couverture tumorale, utilisez l’immunofluorescence dans les tissus fixes pour évaluer la perméabilité vasculaire tmem-mentée.
Pour effectuer la coloration de l’immunofluorescence, préparez d’abord les échantillons décrits dans le protocole textuel, puis effectuez la récupération des antigènes en chauffant les sections immergées dans le citrate près du point d’ébullition pendant 20 minutes. Après avoir laissé refroidir les échantillons à température ambiante pendant 15 à 20 minutes, lavez les échantillons en PBS trois fois pendant deux minutes chaque lavage. Bloquez pendant 60 à 90 minutes en bloquant le tampon, puis incubez des échantillons avec un mélange de rat primaire et d’anticorps rapides qui ciblent respectivement l’endomucin et la tétraméthylrhodamine.
Après l’incubation, lavez les échantillons trois fois en PBST pendant deux minutes chacun. Incuber des échantillons avec un mélange d’anticorps d’âne secondaires contre Rat IgG et IgG rapide, puis laver les échantillons trois fois dans PBST pendant deux minutes chacun. Effectuez une coloration DAPI de routine et montez les diapositives à l’aide d’un support de montage dur sans glycérol.
Conserver les échantillons dans un endroit sombre jusqu’à la numérisation. Pour obtenir des résultats optimaux, numérisez les diapositives sur un scanner numérique à glissière entière. Pour effectuer l’analyse d’images, capturez 10 champs de haute puissance par cas à l’aide de n’importe quel logiciel adapté à la pathologie numérique.
Enregistrez les canaux endomucin et TMR séparément sous le nom de TIFF. À l’aide d’ImageJ, téléchargez les fichiers TIFF et convertissez-les en images 8 bits. Seuilz les images 8 bits au niveau du contrôle négatif et générez deux images binariées montrant les masques endomucin et TMR.
À partir des outils binaires, sélectionnez Remplir les trous sur le masque endomucin. Générez l’image seuil de Dextran et enregistrez-la sous le nom de Roi Dextran. En outre, générer l’image endomucine seuil et l’enregistrer comme roi vasculaire et de générer l’image endomucine inversée et l’enregistrer comme roi extravasculaire.
Ensuite, générer le retour sur investissement extravasculaire et l’image de Retour sur investissement Dextran et l’enregistrer comme Extravascular Dextran ROI. Enfin enregistrer l’image entière comme roi tumoral. Divisez la zone extravasculaire de roi de Dextran par la zone de roi de tumeur et multipliez par 100 pour générer la zone de pour cent que le Dextran extravasculaire couvre dans la tumeur entière.
Répétez le processus pour 10 à 20 champs de haute puissance par cas et générer un Dextran extravasculaire moyen pour chaque cas. On y voit l’image d’une glande mammaire saine et en développement chez un animal transgénique. La vasculature est étiquetée par TMR Dextran en épithélium ductile rouge et mammaire est étiquetée par la protéine fluorescente dendra2 en vert, et les macrophages sont étiquetés par une protéine fluorescente cyan.
En revanche, un carcinome ductile envahissant transplanté dendra2-étiqueté est montré dans un animal avec les macrophages et les récipients étiquetés. Le tissu pulmonaire sain a été visualisé par une fenêtre de poumon-imagerie dans une souris avec la vascularature étiquetée. Les métastases pulmonaires sont évidentes après l’injection de cellules tumorales chez un animal transgénique avec des macrophages et une vascularisation étiquetés.
Montré ici sont des images d’un film d’imagerie intravitale time-lapsed de poids moléculaire élevé Dextran-étiquetés vaisseaux néo-angiogenic dans un carcinome invasif transplanté dendra2-étiqueté du sein. La ligne jaune pointillée indique le contour de la zone transitoire de fuite vasculaire avant, pendant et après l’événement de fuite. Une porte TMEM est capturée dans l’imagerie en direct.
L’immunofluorescence multicanal montre endomucin, poids moléculaire élevé Dextran, leur image fusionnée avec DAPI, aussi bien que le vaisseau sanguin seuil correspondant et les masques extravascular de Dextran. La section séquentielle correspondante de l’immunohistochimie TMEM est également montrée. Le profil vasculaire loin de TMEM apparaît comme profil vasculaire non-leaky, tandis que le profil vasculaire TMEM-associé apparaît comme profil vasculaire fuite.
Il est très important d’éviter de couper les vaisseaux sanguins fournissant la tumeur pendant l’exposition chirurgicale de la tumeur. La méthodologie décrite ici peut être combinée avec le traitement de drogue, même que l’inhibition de la fonction TMEM, la prévention de la perméabilité vasculaire, ou même la normalisation de la vascularisation tumorale pour mesurer leur impact et leur efficacité. Avec ces protocoles, nous avons précédemment démontré que la chimiothérapie améliore la perméabilité vasculaire et la dissémination des cellules cancéreuses et en fait que ces changements pro-métastatiques peuvent être contournés par la co-administration des inhibiteurs de la fonction TMEM.
