هذه التقنيات التكميلية تقييم وقياس نفاذية الأوعية الدموية الورم باستخدام الوزن الجزيئي العالي Dextran. يوفر بروتوكول الأنسجة الثابتة تغطية أكبر للورم، وإنتاجية عالية، ولا يتطلب معدات تصوير متعددة الصور. من ناحية أخرى، يقدم بروتوكول التصوير داخل الرحم معلومات في الوقت الحقيقي حول الحركية، وظيفة، والتفاعل الديناميكي للخلايا في البيئة الدقيقة الورم من الانبثاث أو TMEM.
حتى البروتوكولات المقدمة هنا تمكين القياس المباشر للنفاذية الوعائية TMEM تعتمد والتي ترتبط بقوة مع انتشار الخلايا السرطانية، وبالتالي يمكن استخدام هذه البروتوكولات لتقييم الإمكانات النقيلي للأورام. لتوليد قطع من أنسجة الورم مناسبة للزرع، تبدأ مع القتل الرحيم من الفئران الحاملة للورم كما هو موضح في بروتوكول النص. ضع طبق بيتري مع استزراع خلايا DMEM/F12 المتوسط على الجليد في غطاء الدخان.
جلب الماوس إلى غطاء محرك الدخان وتطهير البطن الماوس مع 70٪ من الكحول الإيثيلي. باستخدام قفازات معقمة وأدوات جراحية، وإزالة الأورام ووضعها في طبق بيتري. قطع الورم إلى قطع صغيرة، والتخلص من أي أجزاء نخرية بينما هم في طبق بيتري.
لزرع قطع الورم في المضيفين المتلقين، تخدير الفئران التي تم رفعها مع الخلايا الضامة المعدلة وراثيا، المسمى الفلورسنت كما هو موضح في بروتوكول النص. تقليل التخدير إلى ما يقرب من 3٪ isofluorane وتطبيق مرهم العيون على عيون الماوس لمنع التجفيف. إزالة الشعر من أكثر من الغدة الثديية الرابعة من الماوس.
بعد تنظيف الجلد مع مطهر، واستخدام أدوات تعقيم لجعل شق صغير ما يقرب من ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات فقط أقل شأنا من الحلمة الرابعة. تشريح حتى يتم الكشف عن وسادة الدهون الثديية. خذ قطعة ورم من طبق بيتري ومعطف في مصفوفة اصطناعية خارج الخلية.
زرع أورام تحت وسادة الدهون ماماري الرابعة. إغلاق شق باستخدام مادة لاصقة سيانوكريل. وأخيرا، إضافة ملليلتر واحد من المضادات الحيوية enrofloxacin إلى waters'drink.
تخدير الماوس وإدخال القسطرة الوريدي الذيل كما هو موضح في بروتوكول النص. جعل شق خط الوسط الطولي بدءا من أعلى على الفور إلى الأعضاء التناسلية وحمل شق يصل إلى مستوى الجانب متفوقة من الغدة الثديية الرابعة. حمل شق عرضية إلى الجانب متفوقة من الغدة الثديية الرابعة.
من المهم تجنب المساس بإمدادات الدم في هذه المرحلة. تحقيق الاستقرار في رفرف الجلد عن طريق لصق قطعة صغيرة من المطاط جامدة قياس اثنين في اثنين من السنتيمتر إلى جانب الجلد من رفرف. يجب أن تكون الأورام في وسط المنطقة التي استقرت بواسطة المطاط.
تطبيق فيلم صغير من سيانوكريلات على الحافة الخارجية لإطار إطار التصوير المخصص. الآن تطبيق قطرة صغيرة من برنامج تلفزيوني إلى وسط الزجاج الغطاء. تجنب الاتصال بين سيانوكريلات على إطار النافذة وPBS على الزجاج لتجنب البلمرة المبكرة من سيانوكريلات.
جفف أنسجة الرفرف المحيطة بها بمسح مختبري. قم بلصق نافذة التصوير الصغيرة على رفرف الأنسجة مع الورم في وسط الفتحة الواضحة. نقل الماوس تخدير والقسطرة الوريد الذيل إلى مرحلة المجهر.
توخى الحذر الشديد لضمان عدم سقوط قسطرة الوريد الذيل. عند هذه النقطة، قم بإجراء التصوير داخل الرحم على المدى الطويل كما هو موضح في بروتوكول النص وفي منشور JoVE السابق. لتحليل أعلى إنتاجية وتغطية أكبر للورم، استخدم الفلوروسين المناعي في الأنسجة الثابتة لتقييم نفاذية الأوعية الدموية بوساطة TMEM.
لأداء تلطّخ الفلورات المناعية، قم أولاً بإعداد العينات كما هو موضح في بروتوكول النص، ثم قم باسترجاع المستضد عن طريق تسخين الأجزاء المغمورة في سيترات بالقرب من نقطة الغليان لمدة 20 دقيقة. بعد السماح للعينات تبرد إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 20 دقيقة، وغسل العينات في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة دقيقتين كل غسل. كتلة لمدة 60 إلى 90 دقيقة في سد العازلة، ثم احتضان العينات مع خليط من الفئران الأولية والأجسام المضادة السريعة التي تستهدف endomucin و tetramethylrhodamine على التوالي.
بعد الحضانة، وغسل العينات ثلاث مرات في PBST لمدة دقيقتين لكل منهما. عينات احتضان مع خليط من الأجسام المضادة حمار الثانوية ضد IgG الجرذان وIgG السريع، ثم غسل العينات ثلاث مرات في PBST لمدة دقيقتين لكل منهما. تنفيذ الروتين DAPI تلطيخ وتركيب الشرائح باستخدام الجلسرين خالية من التصاعد المتوسط الثابت.
قم بتخزين العينات في مكان مظلم حتى المسح الضوئي. للحصول على أفضل النتائج، قم بمسح الشرائح على ماسح ضوئي رقمي كامل الشريحة. لإجراء تحليل الصورة، التقط 10 حقول عالية الطاقة لكل حالة باستخدام أي برنامج مناسب لعلم الأمراض الرقمية.
حفظ قنوات إندوموسين وTMR بشكل منفصل كـ TIFF. باستخدام ImageJ، قم بتحميل ملفات TIFF وتحويلها إلى صور 8 بت. الحد من الصور 8 بت إلى مستوى التحكم السلبي وتوليد صورتين binarized تظهر أقنعة إندوموسين و TMR.
من الأدوات الثنائية، حدد تعبئة الثقوب على قناع إندوموسين. توليد الصورة Dextran thresholded وحفظه كما Dextran ROI. أيضا، توليد صورة endomucin thresholded وحفظها كما العائد على الاستثمار الأوعية الدموية وتوليد صورة إنتوموتشين مقلوب وحفظه كما العائد على الاستثمار الزائد.
بعد ذلك توليد عائدات الاستثمار الخارجية وDextran Dextran صورة متقاطعة وحفظها كما Dextran Dextran العائد على الاستثمار. وأخيرا حفظ الصورة بأكملها كما الورم ROI. تقسيم منطقة Dextran Dextran Dextran Extravascular على منطقة أورام ROI والتكاثر في 100 لتوليد نسبة المساحة التي يغطيها Dextran البذخ في الورم بأكمله.
كرر العملية من 10 إلى 20 حقلًا عالي الطاقة لكل حالة، ثم قم بإنشاء Dextran فاكرافات متوسط لكل حالة. تظهر هنا صورة غدة مامارية صحية، تتطور داخل محور جينيا. يسمى الأوعية الدموية من قبل TMR Dextran في الأحمر, يسمى ظهارة الدكتايل الثديية من قبل dendra2 البروتين الفلورسنت في الأخضر, ويتم تصنيف الضامة من قبل بروتين الفلورسنت السماوي.
في المقابل، يظهر سرطان الدنيلة الغازية المزروعة المسمى dendra2 في يحمل الضامة والأوعية المسماة. تم تصور أنسجة الرئة السليمة من خلال نافذة تصوير الرئة داخل الماوس مع الأوعية الدموية المسمى. نقوش الرئة واضحة بعد حقن الخلايا السرطانية في محور جينيج مع الضامة المسمى والأوعية الدموية.
تظهر هنا هي ال ستيلات من فيلم تصوير intravital من الوزن الجزيئي العالي Dextran المسمى دكستران الأوعية الأوعية الجديدة داخل سرطان dendra2 المسمى زرع الغازية من الثدي. يشير الخط الأصفر المنقط إلى المخطط التفصيلي لمنطقة التسرب الوعائي العابر قبل حدث التسرب وأثناءه وبعده. يتم التقاط مدخل TMEM في التصوير الحي.
متعدد القنوات المناعية يظهر بطانة الرحم، عالية الجزيئية الوزن Dextran، صورتها المدمجة جنبا إلى جنب مع DAPI، فضلا عن الأوعية الدموية عتبة المقابلة وأقنعة ديكستران اكستران خارج vavascular. كما يظهر المقطع التسلسلي المقابل للكيمياء المناعية TMEM. يظهر ملف تعريف الأوعية الدموية بعيدًا عن TMEM كصفيف غير متسرب للأوعية ، في حين يظهر ملف تعريف الأوعية الدموية المرتبط بـ TMEM كتشكيل جانبي الأوعية الدموية المتسرب.
من المهم جدا تجنب قطع الأوعية الدموية التي تزود الورم أثناء التعرض الجراحي للورم. ويمكن الجمع بين المنهجية المذكورة هنا مع العلاج من المخدرات، نفس التي تمنع وظيفة TMEM، ومنع نفاذية الأوعية الدموية، أو حتى تطبيع الأوعية الدموية الورم لقياس تأثيرها وفعاليتها. مع هذه البروتوكولات وقد أثبتنا سابقا أن العلاج الكيميائي يعزز نفاذية الأوعية الدموية ونشر الخلايا السرطانية ، وفعلا أن هذه التغييرات الموالية النقيلي يمكن التحايل عليها من خلال الإدارة المشتركة لمثبطات وظيفة TMEM.
