Эти дополнительные методы оценки и измерения проницаемости опухолевой сосудов с использованием высокоя молекулярного веса Декстрана. Протокол фиксированной ткани обеспечивает более широкий охват опухолями, имеет высокую пропускную способность и не требует многофотонного оборудования для визуализации. С другой стороны, интравитальный протокол визуализации предлагает в режиме реального времени информацию о кинетике, функции и динамическом взаимодействии клеток в микрооквидении опухоли метастазов или TMEM.
Таким образом, представленные здесь протоколы позволяют проводить прямые измерения проницаемости сосудов, зависящих от ТМЭМ, что сильно коррелирует с распространением раковых клеток, поэтому эти протоколы могут быть использованы для оценки метастатического потенциала опухолей. Для генерации кусочков опухолевой ткани, пригодных для трансплантации, начните с эвтаназии опухолевых мышей, как описано в текстовом протоколе. Поместите чашку Петри с DMEM/F12 клеточной культуры среды на льду в дым капот.
Принесите мышь к капоту дыма и дезинфицировать живот мыши с 70% этилового спирта. Используя стерильные перчатки и хирургические инструменты, удалить опухоли и поместить их в чашку Петри. Разрежьте опухоль на мелкие кусочки, отбрасывая любые некротические части, пока они находятся в чашке Петри.
Чтобы пересадить части опухоли в реципиентных хозяев, анестезировать мышей, которые были подняты с генетически модифицированных, флуоресцентно помечены макрофаги, как описано в текстовом протоколе. Уменьшите анестезию примерно до 3%изофлюорана и нанесите офтальмологическую мазь на глаза мыши, чтобы предотвратить высыхание. Удалите волосы из более чем четвертой молочной железы мыши.
После очистки кожи антисептиком используйте стерилизованные инструменты, чтобы сделать небольшой разрез примерно на два-три миллиметра ниже четвертого соска. Рассекаете до тех пор, пока молочная жирная прокладка не будет выставлена. Возьмите кусок опухоли из чашки Петри и пальто в искусственной внеклеточной матрицы.
Трансплантация опухолей под четвертой молочной жировой площадкой. Закройте разрез с помощью клея цианоакрилата. Наконец, добавьте один миллилитр антибиотика энрофлоксацина в питьевую воду животных.
Обезботь мышь и вставить катетер хвостовой вены, как описано в текстовом протоколе. Сделайте продольный разрез средней линии, начиная сразу же превосходит гениталии и нести разрез до уровня высшего аспекта четвертой молочной железы. Носите разрез поперечным к превосходной стороне четвертой молочной железы.
Очень важно, чтобы избежать ущерба для кровоснабжения на данный момент. Стабилизация лоскута кожи путем приклеивания небольшой кусок жесткой резины размером два на два сантиметра к коже стороне лоскута. Опухоли должны быть в центре области стабилизируется резины.
Нанесите небольшую пленку цианоакрилата на внешний край специально изготовленной оконной рамы для визуализации. Теперь нанесите небольшую каплю PBS в центр крышки стекла. Избегайте контакта между цианоакрилатом на оконной раме и PBS на стекле, чтобы избежать преждевременной полимеризации цианоакрилата.
Высушите окружающие лоскутные ткани лабораторной салфеткой. Прикрепите небольшое окно изображения к лоскуту ткани с опухолью в центре четкой диафрагмы. Перенесите обезболивающее катетер мыши и хвостовой вены на стадию микроскопа.
Используйте крайнюю осторожность, чтобы убедиться, что катетер хвостовой вены не выпадет. На данный момент выполните долгосрочную интравитаную визуализацию, описанную в текстовом протоколе и в нашей предыдущей публикации JoVE. Для более высокого анализа пропускной способности и более широкого охвата опухоли используйте иммунофторесценцию в фиксированных тканях для оценки проницаемости сосудов при посредничестве TMEM.
Для выполнения иммунофлуоресценции окрашивания, сначала подготовить образцы, как описано в текстовом протоколе, а затем выполнить поиск антигена путем нагрева разделов, погруженных в цитрат близко к точке кипения в течение 20 минут. После того, как образцы остыли до комнатной температуры в течение 15-20 минут, мыть образцы в PBS три раза в течение двух минут каждый мыть. Блок в течение 60 до 90 минут в блокировании буфера, а затем инкубировать образцы со смесью первичной крысы и быстрых антител, которые нацелены на эндомуцин и тетраметилходамин соответственно.
После инкубации, мыть образцы три раза в PBST в течение двух минут каждый. Инкубировать образцы со смесью вторичных антител осла против Крыса IgG и быстрого IgG, а затем мыть образцы три раза в PBST в течение двух минут каждый. Выполните рутинное окрашивание DAPI и смонтировать слайды с помощью глицерол-свободной жесткой среды монтажа.
Храните образцы в темном месте до сканирования. Для достижения оптимальных результатов сканируйте слайды на цифровом сканере цельного слайда. Для проведения анализа изображений захват 10 высокой мощности полей на случай с использованием любого программного обеспечения, пригодного для цифровой патологии.
Сохранить эндомуцин и ПМР каналы отдельно, как TIFF. Используя ImageJ, загрузите файлы TIFF и преобразуйте их в 8-битные изображения. Порог 8-битных изображений до уровня отрицательного контроля и генерировать два binarized изображения, показывающие эндомуцин и ПМР маски.
Из бинарных инструментов выберите Fill Holes на маске эндомуцина. Создать пороговое изображение Dextran и сохранить его как Dextran roi. Кроме того, создать пороговое изображение эндомуцина и сохранить его в качестве сосудистой рентабельности инвестиций и генерировать перевернутое изображение эндомуцина и сохранить его в качестве экстрасосудистой рентабельности инвестиций.
Далее генерируем пересекаемое экстрасосудивое roi и Dextran ROI изображение и сохранить его как Extravascular Dextran ROI. Наконец сохранить все изображение, как опухоль рентабельности инвестиций. Разделите extravascular Dextran ROI области области опухоли рентабельности инвестиций и умножить на 100 для создания процентной площади, что экстрасосудистый Декстран охватывает во всей опухоли.
Повторите процесс для 10 до 20 высокой мощности полей в случае и генерировать средний Экстрасосудистый Декстран для каждого случая. Здесь показано изображение здоровой, развивающейся молочной железы в трансгенном животном. Сосуды помечены ПМР Декстран в красном, молочный протоковый эпителий помечен флуоресцентным белком dendra2 в зеленом цвете, а макрофаги помечены цианового флуоресцентного белка.
В отличие от этого, пересаженной dendra2 помечены инвазивной протоковой карциномы показано у животного с помеченными макрофагов и сосудов. Здоровая легочная ткань визуализировалась через окно для визуализации легких в мыши с помеченной сосудом. Метастазы легких проявляются после инъекции опухолевых клеток в трансгенное животное с помеченными макрофагами и сосудами.
Показаны здесь являются еще из времени истек интравитальной визуализации фильм высокого молекулярного веса Dextran помечены нео-ангиогенных сосудов в пересаженной dendra2 помечены инвазивной карциномы молочной железы. Пунктирная желтая линия обозначает контур переходной области утечки сосудов до, во время и после случая утечки. Дверной проем TMEM запечатлен в живой визуализации.
Многоканальный иммунофторесценция показывает эндомуцин, высокоя молекулярную вес Декстрана, их объединенное изображение вместе с DAPI, а также соответствующие пороговые кровеносные сосуды и экстрасосудистые маски Декстрана. Показан также соответствующий последовательный раздел иммуногистохимии ТМЭМ. Сосудистый профиль вдали от TMEM отображается как неиспытый сосудистый профиль, в то время как связанный с TMEM сосудистый профиль отображается как вытекающий сосудистый профиль.
Очень важно, чтобы избежать резки кровеносных сосудов, снабжающих опухоль во время хирургического воздействия опухоли. Описанная здесь методология может сочетаться с лекарственным лечением, которое подавляет функцию ТМЭМ, предотвращает проницаемость сосудов или даже нормализует сосуды опухоли для измерения их воздействия и эффективности. С помощью этих протоколов мы ранее продемонстрировали, что химиотерапия повышает проницаемость сосудов и распространение раковых клеток и на самом деле, что эти про-метастатические изменения могут быть обойдены путем совместного введения ингибиторов функции TMEM.
