这些互补技术使用高分子量 Dextran 评估和测量肿瘤血管的渗透性。固定组织协议提供更大的肿瘤覆盖率，高吞吐量，不需要多光子成像设备。另一方面，病毒内成像协议提供有关转移或TMEM肿瘤微环境中细胞动力学、功能和动态相互作用的实时信息。
因此，这里提出的协议能够直接测量TMEM依赖性血管渗透性，这与癌细胞传播有强烈关系，因此这些协议可用于评估肿瘤的转移电位。要生成适合移植的肿瘤组织片段，请从文本协议中描述的带肿瘤小鼠的安乐死开始。将带DMEM/F12细胞培养培养基的培养皿放在烟罩的冰上。
将鼠标带到烟罩，用70%乙醇对小鼠腹部进行消毒。使用无菌手套和手术工具，切除肿瘤，并将其放入培养皿中。将肿瘤切成小块，丢弃任何坏死部分，而他们是在培养皿。
为了将肿瘤片段移植到接受者宿主体内，麻醉小鼠，如文本协议所述，这些小鼠用基因工程、荧光标记的巨噬细胞长大。将麻醉量降低至约3%异氟烷，并涂抹在小鼠眼睛的眼科软膏，以防止干燥。从鼠标的第四个乳腺上去除头发。
用防腐剂清洁皮肤后，使用消毒仪器制作一个小切口，切口大约两到三毫米，只低于第四个奶嘴。解剖，直到乳腺脂肪垫暴露。从培养皿中拿一块肿瘤，用人造细胞外基质涂上外衣。
移植肿瘤下的第四乳腺脂肪垫。使用氰丙烯酸酯粘合剂关闭切口。最后，在动物的饮用水中加入一毫升的苯丙沙星抗生素。
麻醉鼠标，并插入尾静脉导管，如文本协议中所述。使纵向中线切口立即开始优于生殖器，并携带切口到第四乳腺的上级水平。将切口横向进行到第四乳腺的优越方面。
在这一点上，避免损害血液供应至关重要。将一小块硬橡胶（尺寸为两厘米）贴在皮瓣的皮瓣上，以稳定皮肤活门。肿瘤应该位于橡胶稳定区域的中心。
将小薄膜的氰丙烯酸酯涂抹到定制成像窗框的外缘上。现在，在盖玻璃的中心涂抹一小滴 PBS。避免窗框上的氰丙烯酸酯与玻璃上的PBS接触，避免氰丙烯酸酯过早聚合。
用实验室擦拭擦干周围的皮瓣组织。将小成像窗口贴在组织皮瓣上，肿瘤位于透明孔径的中心。将麻醉小鼠和尾静脉导管转移到显微镜阶段。
使用极其小心，确保尾静脉导管不会脱落。此时，执行文本协议和我们之前的 JoVE 出版物中描述的长期病毒内成像。要进行更高的通量分析和更大的肿瘤覆盖率，请使用固定组织中的免疫荧光来评估TMEM培养的血管渗透性。
要进行免疫荧光染色，首先准备文本协议中描述的样品，然后加热浸在柠檬酸盐中靠近沸点的部分20分钟，以进行抗原检索。让样品冷却至室温15至20分钟后，在PBS中清洗样品三次，每次洗涤两分钟。阻断60至90分钟的阻断缓冲液，然后用原生大鼠和快速抗体的混合物孵育样品，分别针对内莫素和四甲苯二胺。
孵育后，在PBST中清洗样品三次，每次两分钟。用二次驴抗体对Rat IgG和快速IgG的混合物孵育样品，然后在PBST中清洗样品三次，每次两分钟。使用无甘油硬安装介质进行常规 DAPI 染色和安装幻灯片。
将样品存放在黑暗的地方，直到扫描。为了获得最佳效果，请扫描数字全幻灯片扫描仪上的幻灯片。要执行图像分析，请使用任何适合数字病理学的软件，每个案例捕获 10 个高功率场。
将内向明素和 TMR 通道分别保存为 TIFF。使用 ImageJ，上传 TIFF 文件并将其转换为 8 位图像。将 8 位图像阈值到负控级别，并生成两个显示内向素和 TMR 蒙版的二进制图像。
从二进制工具中，选择内向膜面上的填充孔。生成阈值的 Dextran 映像，并将其保存为 Dextran ROI。此外，生成阈值内莫素图像，将其保存为血管 ROI，并生成倒置内等素图像，并保存为血管外 ROI。
接下来生成相交的血管外 ROI 和 Dextran ROI 图像，并将其保存为血管外投资回报率。最后将整个图像保存为肿瘤 ROI。将血管外德克斯特兰 ROI 区域除以 Tumor ROI 区域，再乘以 100，生成外血管 Dextran 覆盖整个肿瘤的百分比区域。
对每个案例的 10 到 20 个高功率场重复此过程，并生成每个案例的平均血管外 Dextran。这里展示的是转基因动物中一个健康、发育中的乳腺的图像。血管由TMR Dextran以红色标记，乳腺延展性上皮由绿色荧光蛋白dendra2标记，巨噬细胞由青色荧光蛋白标记。
相比之下，移植的登德拉2标记的侵入性延展癌显示在一种标有巨噬细胞和血管的动物中。健康的肺组织通过小鼠内有标记血管的肺成像窗口进行可视化。肺转移是明显的后，注射肿瘤细胞到转基因动物与标记巨噬细胞和血管。
这里展示的仍然是高分子量 Dextran 标记的新血管在移植的 dendra2 标记的乳房侵入性癌中的时间失效的病毒内成像电影。虚线表示泄漏事件之前、期间和之后瞬态血管泄漏区域的轮廓。TMEM 门在实时成像中捕获。
多通道免疫荧光显示内分素，高分子量Dextran，其合并图像以及DAPI，以及相应的阈值血管和血管外德克斯特兰口罩。同时显示了TMEM免疫组织化学的相应顺序部分。远离 TMEM 的血管轮廓显示为非泄漏血管轮廓，而 TMEM 相关的血管轮廓显示为泄漏的血管轮廓。
在肿瘤的手术暴露过程中，避免切割供应肿瘤的血管是非常重要的。此处描述的方法可以与药物治疗相结合，同样可以抑制TMEM功能，防止血管渗透，甚至使肿瘤血管正常化，以测量其影响和疗效。通过此协议，我们之前已经证明化疗可增强血管渗透性和癌细胞传播，实际上，通过联合管理TMEM功能抑制剂可以规避这些亲转移性变化。
