Bu tamamlayıcı teknikler, yüksek molekül ağırlıklı Dekstran kullanarak tümör vaskülatür geçirgenliğini değerlendirir ve ölçer. Sabit doku protokolü daha büyük tümör kapsama alanı sunar, yüksek iş artışı dır ve multifoton görüntüleme ekipmanı gerektirmez. Öte yandan, intravital görüntüleme protokolü metastaz veya TMEM tümör mikroortamında hücrelerin kinetik, fonksiyon ve dinamik etkileşim hakkında gerçek zamanlı bilgi sunuyor.
Yani burada sunulan protokoller, kanser hücresi yaygınlaşması ile güçlü bir şekilde ilişkili olan TMEM'e bağlı vasküler geçirgenliğin doğrudan ölçülmesini sağlar, bu nedenle bu protokoller tümörlerin metastatik potansiyelini değerlendirmek için kullanılabilir. Transplantasyona uygun tümör dokusu parçaları üretmek için metin protokolünde açıklandığı gibi tümör taşıyan farelerin ötanazisi ile başlar. DMEM/F12 hücre kültürü ortamına sahip petri kabını duman kaputundaki buzüzerine yerleştirin.
Fareyi duman kaputuna getirin ve farenin karnını %70 etil alkolle dezenfekte edin. Steril eldiven ler ve cerrahi aletler kullanarak, tümörleri çıkarın ve Petri kabına yerleştirin. Onlar Petri çanak iken herhangi bir nekrotik porsiyon atarak, küçük parçalar halinde tümör kesin.
Tümör parçalarını alıcı konaklara nakletmek için, metin protokolünde açıklandığı gibi genetiği değiştirilmiş, floresan olarak etiketlenmiş makrofajlarla yetiştirilen fareleri anesteziye alın. Anesteziyi yaklaşık %3 izofluorane düşürün ve kurumasını önlemek için farenin gözlerine oftalmik merhem uygulayın. Farenin dördüncü meme bezi üzerinde saç çıkarın.
Antiseptik ile cilt temizledikten sonra, sadece dördüncü meme aşağı yaklaşık 2-3 milimetre küçük bir kesi yapmak için sterilize aletleri kullanın. Meme yağ yastığı açığa çıkana kadar inceleyin. Petri kabından bir tümör parçası alın ve yapay hücre dışı matris ceket.
Dördüncü meme yağ yastığının altında nakil tümörleri. Kesiyi siyanoakrilat yapıştırıcıkullanarak kapatın. Son olarak, hayvanların içme suyuna bir mililitre enrofloksasin antibiyotik ekleyin.
Fareyi anesthetize edin ve metin protokolünde açıklandığı gibi bir kuyruk ven kateteri takın. Genital yönden hemen üstün başlayan uzunlamasına bir orta hat kesisi yapın ve kesiyi dördüncü meme bezinin üstün yönü seviyesine kadar taşıyın. Dördüncü meme bezinin üstün yönü için kesi enine taşıyın.
Bu noktada kan akımı ödün önlemek için önemlidir. Flepin deri tarafına iki şer santimetre ölçen küçük bir sert kauçuk parçasını yapıştırarak cilt kapağını stabilize edin. Tümörler kauçuk tarafından stabilize edilen alanın merkezinde olmalıdır.
Özel yapım görüntüleme pencere çerçevesinin dış kenarına küçük bir siyanoakrilat filmi uygulayın. Şimdi kapak cam ortasına PBS küçük bir damlacık uygulayın. Siyanoakrilin erken polimerizasyonunu önlemek için pencere çerçevesi üzerindeki siyanoakrilat ile camüzerindeki PBS arasındaki temastan kaçının.
Bir laboratuvar mendil ile çevreleyen flep dokusu kuru. Berrak diyafram ın merkezindeki tümörle doku flebi için küçük görüntüleme penceresi yapıştırın. Anestezili fare ve kuyruk damar kateterini mikroskop aşamasına aktarın.
Kuyruk ven kateterinin düşmemesini sağlamak için çok dikkatli olun. Bu noktada, metin protokolünde ve önceki JoVE yayınımızda açıklandığı gibi uzun süreli intravital görüntüleme gerçekleştirin. Daha yüksek iş analizi ve daha büyük tümör kapsamı için, TMEM aracılı vasküler geçirgenliği değerlendirmek için sabit dokuda immünoresans kullanın.
İmmünofloresan boyama gerçekleştirmek için, önce metin protokolünde açıklandığı gibi örnekleri hazırlayın, ardından kaynama noktasına yakın bir yerde sitrata batırılmış bölümleri 20 dakika ısıtarak antijen alımı yapın. Numunelerin oda sıcaklığına kadar 15-20 dakika soğumasını bekleyin, numuneleri pbs'de her yıkamada iki dakika boyunca üç kez yıkayın. Tampon engelleme 60 ila 90 dakika için blok, daha sonra sırasıyla endomucin ve tetrametethylrhodamine hedef birincil sıçan ve hızlı antikorların bir karışımı ile örnekleri kuluçka.
Kuluçkadan sonra, örnekleri PBST'de üçer kez ikişer dakika yıkayın. Rat IgG ve hızlı IgG karşı ikincil eşek antikorları karışımı ile inkübün örnekleri, daha sonra iki dakika her iki dakika PBST üç kez yıkama. Rutin bir DAPI boyama gerçekleştirin ve gliserol içermeyen sert montaj ortamı kullanarak slaytlar monte.
Örnekleri tarayana kadar karanlık bir yerde saklayın. En iyi sonuçlar için, slaytları dijital tüm slayt tarayıcıda tarayın. Görüntü analizi yapmak için, dijital patolojiye uygun herhangi bir yazılımı kullanarak her durumda 10 yüksek güç alanı yakalayın.
Endomucin ve TMR kanallarını TIFF olarak ayrı ayrı kaydedin. ImageJ'i kullanarak, TIFF dosyalarını yükleyin ve 8 bit lik görüntülere dönüştürün. 8 bitlik görüntüleri negatif denetim düzeyine getirin ve endomucin ve TMR maskelerini gösteren iki binarized görüntü oluşturun.
İkili araçlardan, endomucin maskesiüzerindeki Boşlukları Doldurun'u seçin. Eşikli Dextran görüntüsünü oluşturun ve Dextran Yatırım Getirisi olarak kaydedin. Ayrıca, eşikli endomucin görüntü oluşturmak ve Vasküler Yatırım Getirisi olarak kaydetmek ve ters endomucin görüntü oluşturmak ve Ekstravasküler Yatırım Getirisi olarak kaydedin.
Sonra kesişen Ekstravasküler RoI ve Dextran ROI görüntü oluşturmak ve Ekstravasküler Dextran ROI olarak kaydedin. Son olarak Tümör Yatırım Getirisi olarak tüm görüntü kaydedin. Ekstravasküler Dekstran Yatırım Getirisi alanını Tümör Yatırım Getirisi alanına bölün ve Ekstravasküler Dekstran'ın tüm tümörde kapladığı yüzde alanı oluşturmak için 100 ile çarpın.
Her vaka için 10 ila 20 yüksek güç alanı için işlemi tekrarlayın ve her durum için ortalama bir Ekstravasküler Dekstran oluşturun. Burada gösterilen bir transgenik hayvan içinde sağlıklı, gelişmekte olan meme bezi bir görüntüdür. Vaskülatür Kırmızı TMR Dextran tarafından etiketlenir, meme sünek epitel yeşil floresan protein dendra2 ile etiketlenir, ve makrofajlar bir siyan floresan protein ile etiketlenir.
Buna karşılık, nakledilen dendra2 etiketli invaziv sünek karsinom etiketli makrofajlar ve damarlar ile bir hayvan gösterilir. Sağlıklı akciğer dokusu, fare içinde bir akciğer görüntüleme penceresinden, etiketli vaskülatür ile görselleştirildi. Akciğer metastazları, tümör hücrelerinin makrofaj ve vaskülatür etiketli transgenik bir hayvana enjekte edilmesinden sonra belirgindir.
Burada gösterilen bir nakledilen dendra2 etiketli invaziv karsinom içinde yüksek molekül ağırlıklı Dekstran etiketli neo-anjiyojenik damarların zaman aşımına geçmiş intravital görüntüleme filmi fotoğraf vardır. Noktalı sarı çizgi, sızıntı olayından önce, sırasında ve sonrasında geçici vasküler sızıntı alanının ana hatlarını gösterir. Canlı görüntülemede Bir TMEM kapısı yakalanır.
Çok kanallı immünoreskence endomucin gösterir, yüksek molekül ağırlıklı Dextran, DAPI ile birlikte onların birleştirilmiş görüntü, yanı sıra karşılık gelen eşikli kan damarı ve Ekstravasküler Dextran maskeleri. TMEM immünohistokimyasının sıralı bölümü de gösterilmiştir. TMEM'den uzak vasküler profil sızdırmaz vasküler profil olarak görünürken, TMEM ilişkili vasküler profil sızıntılı vasküler profil olarak görünür.
Tümörün cerrahi maruziyeti sırasında tümörü sağlayan kan damarlarının kesilmesinden kaçınmak çok önemlidir. Burada açıklanan metodoloji ilaç tedavisi ile kombine edilebilir, Aynı TMEM fonksiyonu inhibe, vasküler geçirgenliği önleme, hatta etkilerini ve etkinliğini ölçmek için tümör vaskülatür normalleştirilmesi. Bu protokollerle daha önce kemoterapinin vasküler geçirgenliği ve kanser hücresi yayılmasını artırdığını ve aslında bu pro-metastatik değişikliklerin TMEM fonksiyonunun inhibitörlerinin birlikte uygulanması yla atlatılabildiği gösterilmiştir.
