이러한 보완 기술은 고분자 체중 Dextran을 사용하여 종양 혈관의 투과성을 평가하고 측정합니다. 고정 조직 프로토콜은 더 큰 종양 엄호를 제안하고, 높은 처리량이고, 다중 광자 화상 진찰 장비를 요구하지 않습니다. 한편, 인트라베이티 이미징 프로토콜은 전이 또는 TMEM의 종양 미세 환경에서 세포의 운동, 기능 및 동적 상호 작용에 대한 실시간 정보를 제공한다.
따라서 여기에 제시된 프로토콜은 암 세포 보급과 강하게 상관관계가 있는 TMEM 의존혈관 투과성의 직접적인 측정을 가능하게 하기 때문에, 따라서 이러한 프로토콜은 종양의 전이성 전위를 평가하기 위하여 이용될 수 있다. 이식에 적합한 종양 조직의 조각을 생성하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 종양 을 베어링 마우스의 안락사로 시작합니다. 연기 후드에 얼음에 DMEM / F12 세포 배양 배지와 페트리 접시를 배치합니다.
연기 후드에 마우스를 가지고 70 %에틸 알코올마우스의 복부를 살균. 멸균 장갑과 수술 도구를 사용하여 종양을 제거하고 페트리 접시에 넣습니다. 작은 조각으로 종양을 잘라, 그들은 페트리 접시에있는 동안 어떤 괴사 부분을 폐기.
종양 조각을 받는 호스트로 이식하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 유전자 조작된 형광표 대식세포로 자란 마우스를 마취시킵니다. 마취를 약 3%로 줄이고 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 안과 연고를 적용합니다. 마우스의 네 번째 유방 선 이상에서 머리를 제거합니다.
살균으로 피부를 청소 한 후 살균 된 계측기를 사용하여 네 번째 젖꼭지보다 약 2 ~ 3 밀리미터 작은 절개를하십시오. 매머 지방 패드가 노출 될 때까지 해부. 페트리 접시에서 종양 조각을 가지고 인공 세포 외 매트릭스에 코트.
네 번째 유방 지방 패드 아래에 종양을 이식. 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 절개를 닫습니다. 마지막으로, 동물의 식수에 enrofloxacin 항생제의 1 밀리리터를 추가합니다.
마우스를 마취하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 꼬리 정맥 카테터를 삽입합니다. 성기보다 즉각적으로 발간되는 세로 중형 절개를 만들고 네 번째 유방 선의 우수한 측면의 수준으로 절개를 수행하십시오. 네 번째 유방 선의 우수한 측면에 절개 횡단을 수행.
이 시점에서 혈액 공급을 손상시키지 않도록하는 것이 중요합니다. 플랩의 피부 쪽에 2센티미터 크기의 단단한 고무조각을 부착하여 피부 플랩을 안정화시하십시오. 종양은 고무에 의해 안정화되는 영역의 중심에 있어야합니다.
사용자 정의 이미징 창 프레임의 외부 테두리에 시아노아크릴레이트의 작은 필름을 적용합니다. 이제 커버 유리의 중앙에 PBS의 작은 액적을 적용합니다. 시아노아크릴레이트의 조기 중합을 피하기 위해 창틀의 시아노아크릴레이트와 유리의 PBS 사이의 접촉을 피하십시오.
실험실 닦아 주변 플랩 조직을 건조. 명확한 조리개 중심에 있는 종양으로 조직 플랩에 작은 화상 진찰 창을 부착합니다. 마취 된 마우스와 꼬리 정맥 카테터를 현미경 단계로 옮기.
꼬리 정맥 카테터가 빠지지 않도록 주의하십시오. 이 시점에서 텍스트 프로토콜및 이전 JoVE 간행물에 설명된 대로 장기적인 인트라베이시브 이미징을 수행합니다. 더 높은 처리량 분석 및 더 큰 종양 엄호를 위해, TMEM 매개 혈관 투과성을 평가하기 위하여 고정된 조직에 있는 면역 형광을 이용하십시오.
면역형 염색을 수행하기 위해 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 샘플을 준비한 다음, 20분 동안 끓는 점에 가까운 구연산에 잠긴 부분을 가열하여 항원 검색을 수행한다. 샘플을 실온으로 15-20분 간 식힌 후, PBS에서 매 세척 할 때마다 3 회 세척하십시오. 버퍼를 차단하는 데 60~90분 동안 차단한 다음, 엔도무신과 테트라메틸lrhodamine을 각각 대상으로 하는 1차 쥐와 신속한 항체의 혼합물로 시료를 배양한다.
인큐베이션에 따라 PBST에서 샘플을 각각 2분 동안 세 번 세척합니다. 쥐 IgG및 급속 한 IgG에 대 한 이차 당나귀 항체의 혼합물으로 샘플을 인큐베이션, 다음 2 분 동안 PBST에서 샘플을 세 번 세척. 글리세롤이 없는 하드 마운팅 배지를 사용하여 일상적인 DAPI 염색을 수행하고 슬라이드를 장착합니다.
샘플을 스캔할 때까지 어두운 곳에 보관합니다. 최적의 결과를 얻으려면 디지털 전체 슬라이드 스캐너에서 슬라이드를 스캔합니다. 이미지 분석을 수행하려면 디지털 병리학에 적합한 소프트웨어를 사용하여 사례당 10개의 고출력 필드를 캡처합니다.
엔도무신 및 TMR 채널을 TIFF로 별도로 저장합니다. ImageJ를 사용하여 TIFF 파일을 업로드하고 8비트 이미지로 변환합니다. 8비트 이미지를 음수 제어 수준으로 임계값을 조정하고 엔도무신 및 TMR 마스크를 보여주는 두 개의 바이너드 이미지를 생성합니다.
바이너리 도구에서 엔도무신 마스크의 채우기 구멍을 선택합니다. 임계값에 따라 Dextran 이미지를 생성하고 Dextran ROI로 저장합니다. 또한 임계값에 따라 엔도무신 이미지를 생성하고 혈관 ROI로 저장하여 반전된 엔도무신 이미지를 생성하고 외반 ROI로 저장합니다.
다음으로 교차된 외외 ROI 및 Dextran ROI 이미지를 생성하고 엑스트라안 ROI로 저장합니다. 마지막으로 종양 ROI로 전체 이미지를 저장합니다. 외식 Dextran ROI 영역을 종양 ROI 영역으로 나누고 100을 곱하여 전체 종양에서 엑스트라칸이 커버하는 백분율 영역을 생성합니다.
케이스당 10~20개의 고출력 필드에 대한 프로세스를 반복하고 각 케이스에 대해 평균 엑스트라큘러 Dextran을 생성합니다. 여기에 표시 된 형질 전환 동물 내에서 건강 한 개발 유방 선의 이미지. 혈관은 TMR Dextran에 의해 빨간색, 유방 연성 상피에 의해 표지되고, 녹색에 있는 형광 단백질 dendra2에 의해 표지되고, 대식세포는 시안 형광 단백질 에 의해 표지됩니다.
대조적으로, 이식된 dendra2 표지된 침략적인 성성 암종은 표지된 대식세포 및 혈관을 가진 동물에서 표시됩니다. 건강한 폐 조직은 표지된 혈관과 마우스 내의 폐 화상 진찰 창을 통해 시각화되었습니다. 폐 전이는 표지된 대식세포와 혈관을 가진 형질세포로 종양 세포를 주입한 다음 분명합니다.
여기에 는 유방의 이식 된 dendra2 표지 침습성 암내 고분자 체중 Dextran 라벨 신 혈관 형성 혈관의 시간 경과 인트라비탈 이미징 영화에서 스틸이 표시됩니다. 점선 노란색 선은 누설 이벤트 전, 도중 및 이후에 일시적인 혈관 누설 영역의 윤곽을 나타냅니다. TMEM 출입구는 라이브 이미징에서 캡처됩니다.
다중 채널 면역 불면은 엔도무신, 고분자 체중 Dextran, DAPI와 함께 병합 된 이미지뿐만 아니라 해당 임계 혈관 및 외반 Dextran 마스크를 보여줍니다. TMEM 면역히스토케의 상응하는 순차적 부분도 도시된다. TMEM에서 멀리 떨어진 혈관 프로파일은 비 새는 혈관 프로파일로 나타나며 TMEM 관련 혈관 프로파일은 새는 혈관 프로파일로 나타납니다.
종양의 외과 적 노출 동안 종양을 공급하는 혈관을 절단하지 않도록하는 것이 매우 중요합니다. 여기서 설명된 방법론은 TMEM 기능을 억제하거나, 혈관 투과성을 방지하거나, 심지어 종양 혈관을 정상화하여 충격과 효능을 측정하는 약물 치료와 결합될 수 있다. 이 프로토콜을 통해 우리는 화학요법이 혈관 투과성 및 암세포 보급을 향상시키고 실제로 이러한 전이성 변화가 TMEM 기능억제제의 공동 투여에 의해 우회될 수 있음을 입증했습니다.
