Diese komplementären Techniken evaluieren und messen die Durchlässigkeit der Tumorvaskulatur mit hochmolekularem Dextran. Das Fixed-Tissue-Protokoll bietet eine größere Tumorabdeckung, einen hohen Durchsatz und erfordert keine Multiphotonen-Bildgebungsgeräte. Andererseits bietet das intravitale Bildgebungsprotokoll Echtzeitinformationen über die Kinetik, Funktion und das dynamische Zusammenspiel der Zellen in der Tumormikroumgebung von Metastasen oder TMEM.
Die hier vorgestellten Protokolle ermöglichen somit die direkte Messung der TMEM-abhängigen Gefäßdurchlässigkeit, die stark mit der Verbreitung von Krebszellen korreliert, daher können diese Protokolle zur Beurteilung des metastasierenden Potenzials der Tumoren verwendet werden. Um für die Transplantation geeignete Tumorgewebestücke zu erzeugen, beginnen Sie mit der Euthanasie tumortragender Mäuse, wie im Textprotokoll beschrieben. Legen Sie eine Petrischale mit DMEM/F12 Zellkulturmedium auf Eis in die Dunstabzugshaube.
Bringen Sie die Maus auf die Dunstabzugshaube und desinsieren Sie den Bauch der Maus mit 70% Ethylalkohol. Mit sterilen Handschuhen und chirurgischen Werkzeugen entfernen Sie die Tumore und legen Sie sie in die Petrischale. Schneiden Sie den Tumor in kleine Stücke, werfen Sie alle nekrotischen Portionen, während sie in der Petrischale sind.
Um die Tumorstücke in Empfänger-Hosts zu transplantieren, befeuchten Sie Mäuse, die mit gentechnisch veränderten, fluoreszierend markierten Makrophagen aufgezogen wurden, wie im Textprotokoll beschrieben. Reduzieren Sie die Anästhesie auf ca. 3%Isofluoran und tragen Sie eine ophthalmologische Salbe auf die Augen der Maus auf, um eine Trocknung zu verhindern. Entfernen Sie das Haar von über der vierten Brustdrüse der Maus.
Nach der Reinigung der Haut mit Antiseptika, verwenden Sie sterilisierte Instrumente, um einen kleinen Schnitt etwa zwei bis drei Millimeter nur unter der vierten Brustwarze zu machen. Sezieren, bis das Brustfettpad freigelegt wird. Nehmen Sie ein Tumorstück aus der Petrischale und beschichten Sie es in künstlicher extrazellulärer Matrix.
Transplantieren Sie Tumore unter dem vierten Brustfettpad. Schließen Sie den Schnitt mit Cyanoacrylat-Klebstoff. Zum Schluss einen Milliliter Enrofloxacin-Antibiotikum in das Trinkwasser der Tiere geben.
Anästhetisieren Sie die Maus und fügen Sie einen Schwanzvenenkatheter ein, wie im Textprotokoll beschrieben. Machen Sie einen Längsmittelschnitt, der sofort den Genitalien überlegen beginnt, und tragen Sie den Schnitt bis zum Niveau des überlegenen Aspekts der vierten Brustdrüse. Tragen Sie den Schnitt quer zum überlegenen Aspekt der vierten Brustdrüse.
Es ist wichtig, die Blutversorgung an dieser Stelle nicht zu gefährden. Stabilisieren Sie die Hautklappe, indem Sie ein kleines Stück Hartkautschuk anbringen, das zwei mal zwei Zentimeter misst, an der Hautseite der Klappe. Die Tumoren sollten sich in der Mitte des Bereichs befinden, der durch den Gummi stabilisiert wird.
Tragen Sie einen kleinen Film aus Cyanoacrylat auf den äußeren Rand des maßgeschneiderten bildgebenden Fensterrahmens auf. Wenden Sie nun ein kleines Tröpfchen PBS auf die Mitte des Deckglases an. Vermeiden Sie den Kontakt zwischen dem Cyanoacrylat am Fensterrahmen und dem PBS auf dem Glas, um eine vorzeitige Polymerisation des Cyanoacrylats zu vermeiden.
Trocknen Sie das umgebende Klappengewebe mit einem Labortuch. Befestigen Sie das kleine bildgebende Fenster an der Gewebeklappe mit dem Tumor in der Mitte der klaren Blende. Übertragen Sie die anästhesierte Maus und den Schwanzvenenkatheter auf die Mikroskopstufe.
Seien Sie äußerst vorsichtig, um sicherzustellen, dass der Schwanzvenenkatheter nicht herausfällt. Führen Sie an dieser Stelle eine langfristige intravitale Bildgebung durch, wie im Textprotokoll und in unserer vorherigen JoVE-Publikation beschrieben. Für eine höhere Durchsatzanalyse und eine größere Tumorabdeckung verwenden Sie Die Immunfluoreszenz im festen Gewebe, um die TMEM-vermittelte Gefäßdurchlässigkeit zu bewerten.
Um Immunfluoreszenzfärbung durchzuführen, bereiten Sie zuerst die Proben wie im Textprotokoll beschrieben vor, und führen Sie dann antigenen Abruf durch, indem Sie die in Citrat in der Nähe des Siedepunkts eingetauchten Abschnitte 20 Minuten lang erhitzen. Nachdem Sie die Proben 15 bis 20 Minuten auf Raumtemperatur abkühlen lassen, waschen Sie die Proben dreimal für zwei Minuten. Blockieren Sie für 60 bis 90 Minuten im Sperrpuffer, dann inkubieren Sie Proben mit einer Mischung aus Primärratte und schnellen Antikörpern, die Endomucin bzw. Tetramethylrhodamine zielen.
Waschen Sie die Proben nach der Inkubation dreimal in PBST für jeweils zwei Minuten. Inkubieren Sie Proben mit einer Mischung aus sekundären Eselantikörpern gegen Ratig IgG und schnellem IgG, dann waschen Sie die Proben dreimal in PBST für jeweils zwei Minuten. Führen Sie eine routinemäßige DAPI-Färbung durch und montieren Sie die Dias mit einem glyzerinfreien harten Montagemedium.
Bewahren Sie die Proben bis zum Scannen an einem dunklen Ort auf. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, scannen Sie die Dias auf einem digitalen Ganzdiascanner. Um eine Bildanalyse durchzuführen, erfassen Sie 10 Hochleistungsfelder pro Fall mit jeder Software, die für die digitale Pathologie geeignet ist.
Speichern Sie die Endomucin- und TMR-Kanäle separat als TIFF. Laden Sie die TIFF-Dateien mit ImageJ hoch und konvertieren Sie sie in 8-Bit-Bilder. Schwellen Sie die 8-Bit-Bilder auf die Ebene der Negativkontrolle und erzeugen Sie zwei binarisierte Bilder, die die Endomucin- und TMR-Masken zeigen.
Wählen Sie in den Binärwerkzeugen Füllungslöcher auf der Endomucin-Maske aus. Generieren Sie das dextran-Schwellenbild, und speichern Sie es als Dextran-ROI. Generieren Sie außerdem das schwellende Endomucin-Bild und speichern Sie es als Vascular ROI und generieren Sie das invertierte Endomucin-Bild und speichern Sie es als extravaskulären ROI.
Als nächstes generieren Sie das sich schneidende extravaskuläre ROI und Dextran ROI-Image und speichern Sie es als Extravaskulärer Dextran ROI. Speichern Sie schließlich das gesamte Bild als Tumor ROI. Teilen Sie den Extravaskulären Dextran-ROI-Bereich durch den Tumor-ROI-Bereich und multiplizieren Sie mit 100, um die prozentuale Fläche zu generieren, die der extravaskuläre Dextran im gesamten Tumor abdeckt.
Wiederholen Sie den Vorgang für 10 bis 20 Hochleistungsfelder pro Fall und generieren Sie für jeden Fall einen durchschnittlichen extravaskulären Dextran. Hier ist das Bild einer gesunden, sich entwickelnden Brustdrüse innerhalb eines transgenen Tieres zu sehen. Die Vaskulatur wird durch TMR Dextran in rotem, brustduktiles Epithel beschriftet und durch das fluoreszierende Protein Dendra2 grün und Makrophagen durch ein Cyanfluoreszenzprotein gekennzeichnet.
Im Gegensatz dazu wird ein transplantiertes Dendra2-markiertes invasives duktiles Karzinom bei einem Tier mit markierten Makrophagen und Gefäßen gezeigt. Gesundes Lungengewebe wurde durch ein Lungenbildfenster innerhalb einer Maus mit beschrifteter Gefäße visualisiert. Lungenmetastasen sind nach der Injektion von Tumorzellen in ein transgenes Tier mit markierten Makrophagen und Vaskulatur offensichtlich.
Hier sind Stills aus einem zeitverstrichenen intravitalen Bildfilm mit hochmolekularen Dextran-markierten neoangiogenen Gefäßen innerhalb eines transplantierten Dendra2-markierten invasiven Karzinoms der Brust zu sehen. Die gepunktete gelbe Linie bezeichnet die Umrisse des transienten vaskulären Leckbereichs vor, während und nach dem Leckageereignis. Eine TMEM-Tür wird in Live-Bildgebung erfasst.
Die mehrkanalige Immunfluoreszenz zeigt Endomucin, hochmolekulares Dextran, ihr zusammengeführtes Bild zusammen mit DAPI sowie die entsprechenden schwellenförmigen Blutgefäße und extravaskulären Dextran-Masken. Der entsprechende sequenzielle Abschnitt der TMEM-Immunhistochemie wird ebenfalls gezeigt. Das Von TMEM entfernte Gefäßprofil erscheint als nicht-leaky vaskuläres Profil, während das TMEM-assoziierte Gefäßprofil als undichtes Gefäßprofil erscheint.
Es ist sehr wichtig, zu vermeiden, dass die Blutgefäße, die den Tumor während der chirurgischen Exposition des Tumors versorgen, geschnitten werden. Die hier beschriebene Methode kann mit einer medikamentösen Behandlung kombiniert werden, die die TMEM-Funktion hemmt, die Gefäßdurchlässigkeit verhindert oder sogar die Tumorvaskulatur normalisiert, um deren Wirkung und Wirksamkeit zu messen. Mit diesen Protokollen haben wir bereits gezeigt, dass Chemotherapie die Vaskuläre Permeabilität und die Verbreitung von Krebszellen verbessert und dass diese prometastasierenden Veränderungen durch die gleichzeitige Anwendung von Inhibitoren der TMEM-Funktion umgangen werden können.
